admin Lumene СС крем Абсолютное совершенство SPF 20, 30 мл
Самые выгодные предложения по Lumene СС крем Абсолютное совершенство SPF 20, 30 мл
Нинель А., 10.07.2020
Комментарий: Отличный! Пользуюсь не один год. Попробовала перейти на что-то другое (вдруг что-то новое упустила), но вернулась опять к нему.!!
Alina Lukina, 10.06.2020
Достоинства: Нет у него достоинств
Недостатки: Ужасно сушит, не распределить равномерно, комкается, зернит, все шелушения подчеркивает, даже самые незначительные, кожа от него блестит жирным блеском, никакого подстраивания под кожу, лежит маской, в случае с этими оттенком — белоснежной маской
Любовь А., 28.05.2020
Достоинства: Ровный тон, сияющая кожа.
Недостатки: Нет.
Комментарий: Удобная упаковка.
Наташа П., 15.05.2020
Достоинства: Подстраивается под тон кожи, не вызывает раздражений и прыщи
Недостатки: Нет
Наталья К., 12.05.2020
Достоинства: Удобно носить с собой в косметичке.
Комментарий: Очень легкое покрытие, не для жирной кожи.
love planet, 01.05.2020
Достоинства: Подойдёт для Комби/жирной кожи, даже с хорошей подготовкой и увлажнением сухой кожи, не подошёл.
Недостатки: Для жирной/комби кожи
Имя скрыто, 28.01.2020
Достоинства: Легкий, хорошо выравнивает тон кожи, лицо выглядит более свежим. На коже совершенно незаметен.
Комментарий: Мой любимый тон уже несколько месяцев. Легко наносится даже пальцами. При покупке стоит учитывать, что это СС и недостатков он не перекроет, немного сгладит, но лучше дополнительно использовать консилер.
Лёля К., 29.07.2019
Достоинства: Нет
Недостатки: Ложится на лицо жирной блестящей маской, подчеркивает все шелушения, зернит. Нужно много продукта на лицо.
Комментарий: За такую цену я ожидала хороший СС крем, который будет приятно носить на лице и который будет выравнивать цвет. Вместо этого эффект совершенно противоположный — лицо зернистое, масляное и этот эффект не проходит даже после часа носки, никак не подстраивается
Айзиля Байгазина, 03.06.2019
Достоинства: Практически не чувствуется на лице, отдушка приятная, финиш слегка сияющий, покрытие среднее
Недостатки: Не экономный расход
Тональный СС-крем — Lumene Nordic Girl! Beyoutiful Perfecting CC Cream отзывы покупателей и специалистов на отзовик
Макияж | CC-крем Тональный СС-крем — Lumene Nordic Girl! Beyoutiful Perfecting CC Cream
Краткие характеристики:
Возраст: 18+
Классификация: масс маркет
Сделано в: Финляндия
Страна ТМ: Финляндия
Пользователям нравится:
Общая оценка:
Макияж | CC-крем Тональный СС-крем — Lumene Nordic Girl! Beyoutiful Perfecting CC Cream отзывы
Хотела заказать всеми любимый другой сс крем от lumene, но в последний момент решила взять этот, он тогда был совсем новеньким. Так как моя кожа легко загорает и не прям светлая, то решила взять 2 оттенок. Ох, это была ошибка! Летом идеально, но сейчас я им практически не пользуюсь, только если совсем легкий слой нанести. Но если в нормальном количестве, то лицо будто в медовик опустили на день рождения. Но в остальном — он отличный! Пользуюсь им уже полгода. Он легкий, классно наносится и держится практически весь день. Но будьте внимательны в выборе праймера/увлажняющего крема, потому что на одних скатывается, а на других все норм. В общем, он чудесный, но будьте очень внимательны в выборе тона)
Самый любимый тон. На все случаи. У меня в 1 оттенке (достаточно светлый с нейтральным подтоном)и в 3-на лето. Легко наносится,достаточно стойкий(у меня жирная кожа, не пользуюсь пудрой). Финиш натуральный, тон не заметен на лице. В общем, очень рекомендую к покупке.(мне есть с чем сравнить. В коллекции около 50 тональных средств з масс, проф и люкса)
Крем в принципе неплохо, прыщи не перекроет, но тон выровняет. Подтон, по сравнению с другими кремами скорее серый. Но почему и он исчез с продажи ?
Анастасия, к сожалению, на данный момент, дата поставки данного товара неизвестна. Вы можете воспользоваться функцией «Сообщить о появлении» и как только товар появится в наличии, Вам придет уведомление на электронную почту.
Ответ специалиста
Заказывала тон 01.
Не для белоснежек. Подтон желтоват. Сразу после нанесения заметен на лице, но по прошествии мин 15 уже подстраивается под тон кожи и его не видно. Плотность не сс конечно (скорее bb).
Не скатывается и не забивается в носке. Раздражения за пару раз не вызвал, хотя кожа очень чувствительная. Но каждый день не наношу его.
Сняла звезду за состав.
Большое спасибо MakeUp, как всегда отличный сервис.
Хороший CC, распределяется и ложится на коже равномерно.
Создаёт эффект светящейся кожи, покрытие тонкое и легкое. Финиш немного влажный, держится СС на коже долго.
Немного забивается в мелкие морщины, подчеркивает их.
Отличный сс-крем за свои деньги! Брала 1 тон. Ложится тонким слоем, имеет розовый подтон и с эффектом подсвечивания кожи. Не подчеркивает шелушения, выравнивает тон, делает ее красивого оттенка. Если у вас есть активное акне — не скроет. Но если только следы от акне — то их не подчеркнет, смотрится хорошо. 1 тон подойдет для большинства светлокожих. В чистом виде крем выглядит довольно светлым, но на коже он выглядит намного натуральнее. Я светлокожая, но наносила 1 тон на легкий загар после лета и смотрелось хорошо. На осень-зиму-весну по тону будет хорош. Если вы посмуглее — лучше возьмите тон 2, а то и 3.
Lumene не разочаровывает 🙂
Новый любимчик!
Легкий и приятный CC-крем.
Возможно, не совсем подойдёт обладательницам жирной кожи, поскольку матирующий еффект здесь минимальный, но я влюблена
Брала не здесь, но от крема в восторге.
Очень хорошо ложится, выравнивает тон кожи, при этом очень легкий, нет ощущения маски на лице.
Приятный бонус — довольно хороший состав
Прекрасное средство! Брала 1 оттенок, он не желтит и идеально подходит для блондинок с очень светлой кожей лица. Безупречно на коже держится 10 часов, не жирнит. У меня сухая кожа, поэтому данный крем ещё и ухаживающий эффект применяет. Маскирует мелкие несовершенства.
Оставьте свой отзыв на Тональный СС-крем — Lumene Nordic Girl! Beyoutiful Perfecting CC Cream
Оставить отзыв
Спасибо за отзыв.
Он будет опубликован после проверки модератором!
Характеристики Тональный СС-крем — Lumene Nordic Girl! Beyoutiful Perfecting CC Cream
Все отзывы взяты из открытых источников, либо оставлены посетителями сайта. Администрация сайта otzovik-top ответственности за отзывы не несет.
Lumene CC Color Correcting Cream: обзор с отзывами пользователей
Нашумевшее тональное средство; бюджетный вариант, который часто выбирают и пользователи люксовой косметики; фаворит блогеров; бестселлер финского косметического бренда Lumene. Действительно ли он так хорош? Подробный обзор на этот CC-крем читайте в этой статье.
Производитель представляет данный продукт как легкое, но в то же время стойкое тонирующее средство, которое подойдет для любого типа кожи и не содержит парабенов и следов формальдегида в составе.
Lumene CC Color Correcting Cream содержит арктическую родниковую воду, экстракт арктической морошки и масло семян брусники.
Средство заявлено как многофункциональное: по словам производителя, крем выравнивает тон кожи, скрывает недостатки, имеет светоотражающие пигменты в составе, улучшает состояние кожи лица благодаря ухаживающим ингредиентам, увлажняет ее и защищает от UVA- и UVB-лучей (уровень защиты от солнца – SPF 20).
Данный CC-крем предлагается наносить поверх увлажняющего крема при помощи спонжа или пальцев. Степень покрытия заявлена как средняя.
В линейке на данный момент (после ребрендинга) представлено 6 оттенков. Средство подходит веганам.
Упаковка
CC-крем от Lumene представлен в тюбике из мягкого пластика с откручивающейся крышкой и длинным дозатором–«носиком», что делает использование средства гигиеничным.
Крышка прилегает плотно; крем не вытекает и не пачкает упаковку.
Объем средства – 30 мл. Произведен данный крем в Финляндии.
Технические характеристики
По консистенции СС-крем имеет среднюю плотность; капля средства не растекается на поверхности.
Распределяется по коже при помощи влажного спонжа равномерно без каких-либо усилий. Выравнивает тон кожи и маскирует мелкие несовершенства; для скрытия более серьезных проблем степени покрытия данного CC-крема не хватит и придётся обратиться к помощи консилера.
СС-крем от Lumene поддается наслаиванию – плотность покрытия можно варьировать. Матирует кожу, но при этом придает ей едва заметное свечение «изнутри». Подстраивается под тон кожи.
Стойкость хорошая – крем выдержит рабочий день, не скатываясь и не исчезая с кожи. Не подчеркивает шелушения и не забивает поры.
Отдушка легкая, практически не ощущается, аромат слабовыраженный косметический. Расход у средства достаточно экономичный.
Состав: AQUA (WATER), CYCLOPENTASILOXANE, CYCLOHEXASILOXANE, ISODODECANE, DIMETHICONE, ETHYLHEXYL METHOXYCINNAMATE (OCTINOXATE), POLYGLYCERYL-4 ISOSTEARATE, MAGNESIUM SULFATE, CETYL PEG/PPG-10/1 DIMETHICONE, HEXYL LAURATE, MICA, NYLON-12, PROPYLENE GLYCOL, VACCINIUM VITIS-IDAEA (LINGONBERRY) SEED OIL, RUBUS CHAMAEMORUS (CLOUDBERRY) SEED EXTRACT, CETEARYL DIMETHICONE CROSSPOLYMER, PHENOXYETHANOL, TITANIUM DIOXIDE (NANO), DISTEARDIMONIUM HECTORITE, CERA MICROCRISTALLINA (MICROCRYSTALLINE WAX), DIMETHICONE/DIVINYLDIMETHICONE/SILSESQUIOXANE CROSSPOLYMER, ALUMINUM HYDROXIDE, PROPANEDIOL, PROPYLENE CARBONATE, ETHYLHEXYLGLYCERIN, GLYCERIN, HYDROGEN DIMETHICONE, SODIUM LAUROYL GLUTAMATE, HYDRATED SILICA, TRIETHOXYCAPRYLYLSILANE, LYSINE, MAGNESIUM CHLORIDE, HELIANTHUS ANNUUS (SUNFLOWER) SEED OIL, ROSMARINUS OFFICINALIS (ROSEMARY) LEAF EXTRACT, PARFUM (FRAGRANCE), (CI 77891) TITANIUM DIOXIDE, (CI 77491, CI 77492, CI 77499) IRON OXIDES.
Отзывы пользователей о СС-креме от Lumene
Как известное, тональное средство является одним из наиболее индивидуальных декоративных продуктов. Соответственно, отзывы на данное средство можно встретить совершенно разные – от восторженных до кране негативных.
В положительных отзывах покупатели отмечают лёгкость в нанесении и распределении средства по коже, ровное покрытие, которое дает данный крем. По словам пользователей, CC-крем хорошо ведет себя на коже: не выглядит маской, не забивает поры и не проваливается в них, не вызывает воспалений, матирует жирную и комбинированную кожу и при этом комфортно ощущается на сухой, а так же не конфликтует с другими декоративными продуктами в макияже.
Приятным бонусом является относительно не высокая стоимость средства; однако, его цена заметно выросла после ребрендинга (как и стоимость остальной продукции Lumene), и теперь продукт можно с натяжкой отнести к сегменту масс-маркета.
Среди отрицательных отзывов можно встретить упоминания о том, что CC-крем Lumene не застывает на коже после нанесения и не фиксируется на ней, и, соответственно, отпечатывается на одежде, плывет, проваливается в поры в течение дня, забивается в складки, а так же может подчеркивать шелушения. Некоторые покупатели отмечают, что крем может провоцировать воспаления и забивать поры.
Не все довольны стойкостью данного средства – у некоторых этот крем держится на коже всего 4-5 часов.
Вывод:
Стоит ли покупать CC-крем от Lumene? Однозначно ответить на этот вопрос сложно. Если вы являетесь обладателем проблемной кожи, особенно комбинированной с расширенными порами или склонной к жирности – советуем протестировать средство перед покупкой и понять, подходит ли оно именно вашей коже.
Посмотрите также обзоры в формате видео на CC-крем от Lumene:
Мой отзыв о CC креме «Абсолютное совершенство» Lumene CC Color Correcting Cream 6 in 1 SPF 20 – выдержит ли он стандартный 8-часовой рабочий день?
Доброго январского дня всем BeautyПатрулям!
В этом отзыве хочу поделиться о легендарном CC креме «Абсолютное совершенство» Lumene CC Color Correcting Cream 6 in 1 SPF 20. Пока это один из самых любимых cc-кремов. Причем после начала применения bb- и cc-кремов я поняла, что мне будет тяжело вернуться к обычным плотным тональным средствам.
Продается средство вот в такой упаковке. Мой оттенок – светлый.
Объем – 30 мл.
Страна производства – Финляндия.
У крема очень нежная текстура, буквально тает при нанесении на кожу.
Свотчи на руке сделаны при холодном лампочном свете:
НА этих фото «голое лицо» без какого-либо макияжа:
Нанесла cc-крем на увлажняющий крем:
Завершила макияж, на cc-крем нанесла матирующую пудру от NYX:
Сразу после нанесения напротив окна — сделано на айфон:
Еще одно фото на камеру после нанесения с пудрой:
Фото спустя 8 часов после нанесения, в течение дня макияж не подправлялся:
Тест матирующей салфеткой спустя 8 часов:
Что я могу сказать после использования? Отличное средство, которое хорошо подстраивается под тон кожи.
Есть нюанс: в новом состоянии в начале использования нельзя его держать в вертикальном положении, так как если Вы откроете колпачок, то на кисть/спонж и т.п. выдавится автоматически очень много средства, которое Вы потом не сможете обратно вернуть в тюбик :(
Куплю ли я еще раз? 100 из 100%, что куплю еще.
P.S. Мои отзывы о других бб и сс-кремах и кисти, с помощью которой наношу средство:
Мой отзыв о Sephora PRO Кисти для ультра жидкой тональной основы № 83
Мой отзыв о BB-креме Vivienne Sabo ВВ-Creme
Мнение о ВВ-креме Maybelline Dream Pure BB для комбинированной и жирной кожи
Мнение о невидимом тающем тональном средстве GUERLAIN Lingerie de Peau Beauty Booster
Отзыв о BB креме Garnier Секрет Совершенства для смешанной и жирной кожи
Lumene CC cream отзыв : kuzmanafanya — LiveJournal
СС-крем Lumene давно заслужил звание «отличника» от масс-маркета. Его по праву сравнивают с лучшими тональными и заносят в списки маст-хевов. Мои же отношения с данным CC-кремом сложились не сразу и не совсем гладко, так что отзыв затянулся во времени.
БиБи и СиСи кремы стали настолько популярны, что каждая марка считает своим долгом выпустить пару-тройку таких средств. Правда, чем они отличаются от старых добрых тональных кремов и праймеров, так и не понятно. Да, заявлены свойства 6-в-1 или даже больше, но ВВ не обеспечивает полноценного увлажнения или защиты от солнца, как отдельное узкоспециализированное средство. ВВ- и СС- делают всего понемногу: слегка тонируют, увлажняют, содержат как правило небольшой СПФ.
Тем не менее, среди всей армии тонированных увлажнителей есть отдельные выдающиеся экземпляры, заслуживающие внимания. Да, тот самый CC-крем Lumene. Я бы его отнесла к тональным средствам с легкой текстурой, нежели к уходовым. Увлажнять кожу перед тоном обязательно, иначе сюрпризов с проваливанием в поры и внезапными шелушениями не избежать.
Так вот, СС Lumene очень легкий, невесомый флюид. На лице распределяется идеально, просто руками как увлажняющий крем. Не оставляет полос, разводов, границ. В составе нет спирта, поэтому теоретически CC-крем можно наносить и под глаза. Степень маскировки слабая и по-моему, не поддается наслаиванию. Небольшие покраснения станут менее заметными, но серьезные дефекты CC Lumene не скроет.
Чем же так хорош CC Lumene? Думаю, всеобщую любовь он сыскал за счет того, как преображает кожу. Он имеет красивый, чуть влажный финиш, придает благородное сияние и отлично оживляет. При желании блеск можно прибить пудрой, она же продлит стойкость покрытия. Я не смогла носить CC Lumene летом, кожа с ним становилась жирнее, да и оттенок #light был слишком светлый. Зато теперь, зимой он весьма кстати: не сушит кожу, выравнивает тон, подсвечивает.
Итого: CC-крем Lumene можно назвать легким тональным, он делает кожу красивей, эффект светоотражения придает сияние. Стойкость не самая выдающаяся, к концу дня он может таять, а летом и вовсе стекать, обладателям жирной кожи не понравится. Оттенок #light светлый, но не универсальный. На полтона он может подстоиться, но при очень бледной, белой коже или минимальном загаре не подойдет.
Lumene CC Color Correcting Cream
Тональный крем от производителя Lumene — Lumene CC
Многие знакомы с таким средством, как тональный крем, но не многие знают его историю и почему к нему так часто негативно относятся. Тональный крем Lumene докажет и расскажет про свои достоинства.
Раньше тональные крема были такими плотными, что им давали невежливое значение «замазки». Кожа девушек и женщин под слоем тонального крема превращалась в маску, вот откуда пошел миф, что под тональным кремом кожа «не может дышать». Сейчас косметология продвинулась гораздо вперед.
Крем Lumene CC Color Correcting Cream превратит кожу в идеальную, глянцевую, бархатную. Вам будет приятно на нее смотреть, а остальным любоваться. Средство обеспечивает качественное покрытие из-за высокой концентрации цветовых пигментов. А еще оно как 3 в 1: обладает свойствами тональной основы, консилера и базы под макияж. Вы легко сможете распределить крем по коже, создав для нее лучший вид. Что получите в результате от Lumene CC Color? Бархатный, чарующий, матовый эффект кожи.
Cпособ применения: небольшими мазками распределить по щекам, на лоб и подбородок, растушевать круговыми движениями подушечек пальцев или спонжем от центра к периферии лица. Далее не трогать тональный крем, нанесенный на лицо, чтобы не испортить общий вид.
Тип кожи: все типы.
Время применения: универсальное.
Страна: Финляндия.
Преимущества тональный Lumene CC Color Correcting Cream:
- Легко сольется с тоном кожи;
- Замаскирует несовершенства;
- Разгладит кожу;
- Придаст красивое, здоровое сияние;
- Продержится весь день;
- Защитит от УФ-лучей.
Кроме того, тональный крем, который вы можете купить в Arlet, характеризуется приятной стоимостью. Заказать его проще простого. Кликните по ссылке Lumene CC Color и попадете на сайт Arlet c представленным товаром. Вы также можете позвонить представителю сайта Arlet и сделать заказ у него.
Зачем использовать тональную основу?
Тональный крем используется для того, чтобы скрыть наши недостатки. Кроме того, тональная основа — отличная база для макияжа. Это средство держится на коже 3-4 часа, а после «смешивается» с кожным жиром. Когда это происходит — тональный крем необходимо нанести еще раз. Любой тональный крем можно использовать в течение 1,5 лет. Если у крема появился странный, неприятный запах, использовать далее его уже не нужно.
Полезный лайфхак: при покупке тонального крема большинство людей тестируют его на руке, но это в корне неправильное решение. Тональный крем необходимо тестировать на лице, кожа лица отличается от рук, и дает более верное предположение, подходит Вам именно этот продукт или нет.
Сolor correcting cream Lumene станет Вашим любимым хитом. Он поможет скрыть недостатки, подчеркнуть достоинства, сделает макияж и общий вид более совершенным. Мы уверены, этот крем — находка для тех, кто в поиске качественного товара. Менеджеры сайта Arlet в ожидании Вашего заказа!
CC Color Correcting Cream от финского производителя Lumene – невесомый и стойкий тональный крем нового поколения с революционной формулой. Это, по сути, средство 3 в 1, ведь крем соединил в себе свойства тоналки, консилера и базы под макияж, при этом он имеет чрезвычайно нежную текстуру, что отлично ложится на подготовленную кожу.
Тональный Люмен СС крем, цена которого доступна в магазине Arlet, имеет способность подстраиваться под тон вашей кожи, при этом отлично маскируя ее недостатки. Он скроет пигментные пятна, покраснения и неровности кожи, матирует проблемные участки, визуально уменьшает поры. При этом средство еще и ухаживает, защищает кожу от негативного УФ-излучения.
CC Cream Lumene CC Color Correcting
Девочки, всем привет! на данный момент поведаю о моем совершенном тональном креме – CC Cream Lumene CC Color Correcting. С опаской, в отзыве находятся макро-фото проблемной кожи!
Пара месяцев назад об этом креме заговорили, думается, все! И я, конечно же, не смогла пройти мимо данной новинки. В Минске купила его всего за 66 тысяч (7$), тон Medium.
Для начала – пара слов от производителя.
CC КРЕМ “Полное СОВЕРШЕНСТВО”
Идеальная кожа мгновенно! Бархатистая, сияющая кожа и легкий матирующий эффект в течение всего дня.
Это невесомое, но наровне с этим стойкое тонирующее средство снабжает идеальное покрытие за счет лишь высокой концентрации цветовых пигментов. Для всех типов кожи. Без парабенов. 30 мл
Неповторимый продукт 6 в 1:
Сливается с тоном кожи
Маскирует несовершенства
Разглаживает
Придает здоровое сияние
Держится целый дни
Защищает от УФ-лучей (SPF 20)
Упаковка крема очень успешная – стильная и эргономичная. Отдельное благодарю производителю за узкий носик тюбика – обожаю тональные средства с таким дозатором.
Консистенция у крема в меру густая – не растекается, наровне с этим легко распределяется по коже. Запаха крем не имеет (разве что чуть уловимый запах свежей глины – если очень уж сильно принюхаться:)
Оттенок крема сначала думается темноватым – но спустя пара секунд по окончании нанесения он подстраивается под кожу и делается целиком и полностью незаметным.
А на данный момент – самое главное. Фотографии на коже. Слабонервных прошу уйти (или пролистать эти фотографии как вероятно скорей:). Кожа у меня комбинированная, проблемная, пористая, с куперозом, чёрными точками – в другом случае говоря полный багаж.
А на данный момент посмотрите, как моя кожа выглядит с СС-кремом Люмене
Само собой очевидно, я отдаю себе отчет в том, что и по окончании применения крема кожа не выглядит идеальной, НО! Для меня это – хороший результат! Поры стали менее заметными, чёрные точки и купероз замаскированы превосходно.
Лоб кроме этого выглядит превосходно, только на момент фотографирования у меня обветрилась кожа, и крем мало выделил шелушения между бровей. Это единственный минус СС крема Люмене.
И бессердечное макро:) Тут, кстати, заметно то самое сияние, о котором заявляет производитель. По эффекту это свечение схоже с тем, что дает щекотливый хайлайтер. Замечу, что сияние проявляется только под вспышкой, при дневном свете его не видно, кожа выглядит и отдохнувшей.
И фотографии в полу-образе, так сказать:)
И фото спустя 7 часов по окончании нанесения крема. В тот дни было очень туманно, моросил ливневой дождь – я гуляла целый дни без зонта. Как видите, крем остался на месте, только лоб чуть заблестел. Замечу, что по окончании приобретения этого крема я прекратила пользоваться пудрой! Мне хватает того матирования, что дает СС-крем. В течение дня легко 1-2 раза промокаю лицо бумажной салфеткой. Крем держится в течение всего дня, никуда не уплывает.
Смываю я его несложной пенкой для умывания, затем протираю кожу ватным диском, смоченным тоником. Никакими особенными средствами для демакияжа не пользуюсь, крем очень легко смывается, поры не забивает.
Стоит ли заявить, что я очень довольна этим кремом? Это лучшее тональное средство, что у меня было! Моей проблемной коже он подошел идеально. Пользуюсь им 3 месяца, каждый день. Поры он мне не забивает. И никогда мне не говорили столько комплиментов по поводу того, как свежо я выгляжу, как в эти 3 месяца! Думаю, во многом это заслуга крема:)
Итак, главные, на мой взгляд, преимущества этого крема:
Сглаживает тон лица
Придает здоровое сияние
Маскирует поры, покраснения, чёрные точки
Матирует на пара часов
Увлажняет кожу
Стойкий
Имеет высокую степень УФ-защиты
Не затыкает поры
Вот и целый рассказ:) Будьте красивыми!
Вторая косметика в этом отзыве:
Тушь
Румяна
Помада
P.S. Девочки-белоруски! В сентябре в сети “Мила” акция на СС-его цена – и крем всего 109.900. Всем, кто еще не пробовал это средство, очень рекомендую!
UPD: сравнительно не так давно закончила очередной тюбик СС-крема и купила его уже в обновленной версии, спешу поделиться с вами сравнением.
Упаковка стала более яркой, примечательной, дизайн “осовременился”.
Составы в первой и второй версии целиком и полностью подобны:
Главное отличие новой версии – более толстый и маленький “носик” тюбика. Не назвала бы это обновление успешным – узкий “носик” мне нравился больше, но и к новому я не так продолжительно осталось ожидать приноровилась.
В остальном кремы ничем не отличаются. Тон, отдушка, нанесение, стойкость и прочие характеристики на 100% совпадают, что меня очень порадовало.
Равно как и прежде горячо рекомендую этот крем всем! Уже два года пользуюсь только этим тональным средством, для меня это легко идеальный продукт?
«Люмен». СС-крем. Отзывы об одной из самых удачных новинок
Широкая публика еще не успела устать от BB-кремов, как появились их более продвинутые аналоги — SS-кремы (по следующей букве алфавита). Идеальный тон лица без эффекта маски, идеальное слияние с естественным цветом кожи, увлажнение, стойкость и ощущение комфорта на весь день — все это обещает компания SS-крем «Люмен». Отзывы о нем рисуют тот самый идеал, к которому безуспешно стремятся многие девушки.Но неужели у него вообще нет недостатков?
Положительные отзывы
Крем прост в использовании: отлично ложится по лицу, легко ложится, отлично ложится даже на кожу вокруг глаз (хотя, конечно, не для нее, но многие были так очарованы этим продуктом, что они отложили в сторону все свои обычные средства).
Крем имеет необычную консистенцию: сначала жидкий, в первую минуту после нанесения заметно блестит, затем становится очень мягким и пудровым.Еще одно преимущество — его можно использовать как эквалайзер! Например, чтобы скрыть локальные покраснения, нужно наносить SS-крем «Люмен» только на проблемные места, тщательно растушевывать, и он отлично сольется с кожей, красный скроет, а границы «пятна» будут быть полностью невидимым. Многие девушки, например, с очень темной или очень светлой кожей, которые долгое время не могли найти тональное средство подходящего оттенка, наконец нашли свой идеал в линейке «Люмен». SS-крем, отзывы о котором пишут самые разные девушки, отлично адаптируется к любому индивидуальному оттенку кожи.
Как известно, тональные средства лучше наносить на увлажняющую основу, иначе они подчеркнут все шелушения и неровности. SS-крем «Люмен», отзывы о котором в большинстве своем восторженные, настолько хорошо справляется с увлажнением, что даже слегка разглаживает мелкие морщинки. Это видно практически на всех фотографиях. Он один способен заменить базу под макияж, корректор и тональ.
Кожа под кремом не потеет, при этом средство не потеет.требует обновления в течение дня и способна выдержать даже спортивное мероприятие. Хорошо переносит жару, не плавает и не остается на одежде. Запах оценивают по-разному: кто-то говорит об аромате ягод, кто-то о довольно приятном, но стандартном косметическом аромате.
«Люмен». СС-крем. Отзывы тех, кто еще остался недоволен
Это действительно потрясающее средство, о котором очень мало критических отзывов. Среди мелких претензий к крему:
1.Не экономично. Он очень активно впитывается кожей и расходуется относительно быстро. Возможно, это так, но цена крема приемлема, чтобы позволить себе использовать его в желаемом количестве.
2. Поры напряжения, чрезмерно толстые, плохо распределенные — такие обзоры на фоне сотен противоположностей выглядят довольно неубедительно. Возможно, это плохо хранящийся товар или подделка.
3. Оставляет следы на одежде. Это противоречит отзывам, в которых говорилось о его сверхпрочности.
4. Через некоторое время после нанесения он меняет цвет с натурального на морковно-оранжевый и вызывает шелушение — это утверждение озвучено всего в одном обзоре, возможно, речь шла также о испорченном продукте, подделке или была аллергия на какой-то компонент крема.
Также можно найти другие отрицательные отзывы. Например, одна из дам пишет: «Я была в восторге, у меня была такая идеальная кожа, как у него, ее не было, использовала каждый день, но через несколько месяцев кожа стала явно хуже — появились царапины. , болезненные прыщики.Крем пришлось выкинуть, а кожа была длинной и грустно лечить. Посмотрела состав — теперь понимаю, в чем дело. Химия в химии! «И это говорят не просто обычные пользователи, а блогеры, которые постоянно пробуют разный макияж, и им есть с чем сравнить SS-крем« Люмен ».
Отзывы зарубежных блогеров
В целом крем за рубежом пользуется успехом. Пользователи пишут, что он отлично скрывает недостатки, выглядит очень естественно, не вяжет морщинки на коже.Однако в очень многих, даже положительных отзывах отмечаются минусы объекта, что говорит об объективности таких отзывов. Например, финишу не хватает пудры для жирной кожи, да и вообще крем в первый час довольно блестит и только потом садится, сложно подобрать цвет девушкам с очень белой кожей (об этом упоминалось отзыв одного блоггера из Финляндии). Средняя оценка на одном из зарубежных сайтов с обзорами составляет 4,4 балла (67 отзывов), при этом 85% покупателей покупают этот инструмент снова.Неплохой результат!
Что делать тем, кто не любит? Слишком тяжелый, слишком липкий, слишком оранжевый — на это, как всегда, жалуются дамы с очень тонкой белоснежной кожей. По техническим характеристикам тоже не все хвалят «Люмен» (СС-крем). Особенно критичны отзывы обладательниц комбинированной кожи: с увлажняющим кремом она истощает, а без крема сушит и подтягивает лицо. Правда, эту проблему можно решить: тщательно подготовить кожу к пилингу, а затем дать крему примерно полчаса, чтобы он сморщился.
выводы
Это действительно прорыв от достаточно бюджетной марки «Люмен». SS-крем, отзывы о котором восторженные, чем о каком-либо подобном люксовом продукте, действительно заслуживает внимания. Его недостатки незначительны, а что касается тяжелого состава, не стоит забывать, что этот крем предназначен не столько для ухода, сколько для создания декоративного эффекта. Ведь приставка SS означает «контроль цвета». То есть основная функция такого продукта — создание безупречного цвета лица.Наверное, мы все еще ждем выхода кремов новых поколений, например DD, еще более совершенных и действительно представляющих два, три или четыре средства в одном.
люмен. СС крем. Отзывы об одной из самых удачных новинок
Широкая публика еще не успела устать от BB-кремов, как появились их более продвинутые аналоги — кремы SS (по следующей букве алфавита). Идеальный тон лица без эффекта маски, идеальное слияние с естественным цветом кожи, увлажнение, упругость и ощущение комфорта в течение всего дня — все это обещает CC-крем от Lumene.Отзывы о нем рисуют тот самый идеал, к которому безуспешно стремятся многие девушки. Но разве у него нет недостатков?
Положительный отзыв
Крем удобен в использовании: отлично распределяется по лицу, легко накладывается, отлично ложится даже на кожу вокруг глаз (хотя, конечно, не предназначен для этого, но многие были так очарованы этим продуктом, что отложили в сторону все свои обычные средства).
Крем имеет необычную консистенцию: сначала жидкий, в первую минуту после нанесения заметно блестит, затем становится очень мягким и пудровым.Еще одно преимущество — его можно использовать как корректор! Например, чтобы скрыть локальное покраснение, следует наносить крем Lumena SS только на проблемные участки, тщательно его растушевывать, и он будет идеально сливаться с кожей, скроет покраснение, но границы пластыря будут полностью незаметны. Многие девушки, например, с очень темной или очень светлой кожей, которые долгое время не могли подобрать тональное средство подходящего оттенка, наконец-то нашли свой идеал в линейке Lumen. CC-крем, отзывы о котором пишут самые разные девушки, отлично адаптируется к любому индивидуальному тону кожи.
Как известно, тональные средства лучше всего наносить на увлажняющую основу, иначе они подчеркнут все шелушения и неровности. Крем CC Lumene, отзывы о котором в основном восторженные, настолько справляется с гидратацией, что даже слегка разглаживает мелкие морщинки. Это видно практически на всех фото. Только он способен заменить основу под макияж, консилер и тональный крем.
Кожа под кремом не потеет, при этом продукт не требует обновления в течение дня и выдержит даже спортивное мероприятие.Хорошо переносит жару, не плавает и не остается на одежде. Запах оценивают по-разному: кто-то говорит об аромате ягод, кто-то о довольно приятном, но стандартном косметическом аромате.
люмен. СС крем. Отзывы тех, кто еще остался недоволен
Это действительно потрясающий инструмент, о котором крайне мало критических отзывов. Из второстепенных претензий к крему можно выделить следующие:
1. Не экономичен. Он очень активно впитывается кожей и относительно быстро расходуется.Возможно, здесь стоит быть, но цена крема вполне приемлема, чтобы позволить себе использовать его в том количестве, в котором он требуется.
2. Подчеркивает поры, чрезмерно толстые, плохо распределенные — такие отзывы на фоне сотен противоположных выглядят совершенно неубедительно. Возможно, это плохо хранившийся товар или подделка.
3. Оставляет следы на одежде. Это противоречит отзывам, в которых говорилось о его сверхпрочности.
4. Через некоторое время после нанесения он меняет цвет с натурального на морковно-оранжевый и вызывает шелушение — такое заявление было озвучено только в одном обзоре, возможно, это был испорченный продукт, подделка или была аллергия на какой-то компонент. крема.
Можно встретить и другие отрицательные отзывы. Например, вот что пишет одна из дам: «Я была в восторге, у меня не было такой идеальной кожи, как раньше, я пользовалась ею каждый день, но через несколько месяцев кожа явно стала хуже — подкожно, болезненно. появились прыщи. Крем пришлось выбросить, а кожа стала длинной и грустно обработанной. Посмотрела композицию — теперь понимаю, в чем дело. Химия в химии! И это говорят не обычные пользователи, а блогеры, которые постоянно пробуют разную косметику, и им есть с чем сравнить «Люмен» с СС-кремом.
Отзывы зарубежных блогеров
В целом за рубежом крем пользуется успехом. Пользователи пишут, что он отлично скрывает недостатки, выглядит очень естественно, не слипается в морщинах кожи. Однако во многих, даже положительных, отзывах присутствуют и обратные стороны инструмента, что свидетельствует об объективности таких отзывов. Например, финиш недостаточно пудровый для жирной кожи, и в целом крем довольно сильно блестит в первый час и только потом оседает, девушкам с очень белой кожей сложно выбрать цвет (об этом говорилось в обзор блогера из Финляндии).Средняя оценка на одном из зарубежных сайтов с обзорами составляет 4,4 балла (67 отзывов), при этом 85% покупателей купили бы этот инструмент еще раз. Хороший результат!
Что говорят те, кто не любит? Слишком тяжелый, слишком липкий, слишком оранжевый — на это как всегда жалуются дамы с очень тонкой белоснежной кожей. По своим техническим характеристикам не все хвалят и Люменс (СС-крем). Особенно критичны отзывы обладательниц комбинированной кожи: она стекает с увлажняющего крема, а без крема сушит и подтягивает лицо.Правда, эту проблему можно решить: тщательно подготовить кожу к пилингу, а затем дать крему примерно полчаса, чтобы он сморщился.
выводов
Это действительно прорыв от достаточно бюджетной марки «Люмен». СС крем, отзывы о котором восторженные, чем о любом подобном люксовом продукте, действительно заслуживает внимания. Его недостатки незначительны, а что касается тяжелого состава, не стоит забывать, что этот крем не столько для ухода, сколько для создания декоративного эффекта.Ведь приставка SS означает «контроль цвета». То есть основная функция такого продукта — создание безупречного цвета лица. Наверное, мы все еще ждем выхода кремов новых поколений, например DD, еще более продвинутых и действительно представляющих два, три или четыре продукта в одном.
«Люмен». СС-крем. Отзывы li ser ku yek ji berhemên nû herî serkeftî
SS-kremên (дзи бо намея рядом джи альфабея) — Di raya giştî de hê dema ku bored bi kremên BB wek rexên xwe çêtir bûn hebû ne.ton çerm Perfect bêyî bandora mask de, li fusion bêkêmahî ya ku bi rengê çerm xwecihaxêv, Hydration, serûberî û handana hemû roj — ew sozên ku ji bo avakirina şîrketeke «Lumen» SS-cream. Ответы li ser wî bikişînî a îdeal, eynî, ku serkeftin ji bo gelek ji girls digerin. Lê bi rastî ew не имеет kêmasîyên?
Deng erênî
Крем bikaranîna wan hêsan e: baş-belavkirin li rûyê, bi rehetî qatî, bi temamî xwe eware dike, heta di çerm de li dora çavên (tevî, bê guman, ew di ne jiman деме де гелек би вэ берхема ку дайнин алики, хем риен асайи ви да дикишандин бун).
Di vê nîgarê cream nedîtî: yekem, ew rohn e zirufê ronahî Di deqîqeya pêşî piştî serlêdana, lê piştre ew pir nerm û пудровый. sûd din — ew dikarin wek proofreader bikaranîn! Ji bo nimne, ji bo veşartina sorbûn, herêmî, divê tu SS-cream «Lumen» bi tenê li ser herêmên pirsgirêk, bi baldarî zêrevana wan derbas dibe, û ku bi temamî bi çerm, hide sorbên «pîney demi» sînorên merge, dê bi temamî nayên dîtin. Гелек дзин, дзи бо нимуне, би а шерм пир тари ан пир сивик, ку хета демеке диредж джи ди бин си мафе дамезрандина пейда не, ди давийе де îdeal wî yên ли сер хета «Люмен» нехате дитин.обзоры SS-cream bi girls pir cuda hatiye nivîsîn, bi temamî ji hemû deng û awazek çerm şexsî û biguncîne.
Ev tê zanîn ku çavkaniyên tonal baştir ku li ser bingeheke Koma Rew, an na dê hemû topped û xwedêgiravî h’emű. СС-крем «Люмен», ку отзывы bi piranî rave li pir baş ji heqî rewa xwe bi xwe, heta bi sivikî разглаживает жир. Ev dikare di hema hema hemû wêneyên dîtin. Ew bi serê xwe nikare şûna e bingeheke ji bo макияж, консилер û bingeh.
erm di bin cream nade xwêdana ne, hacetê pêwîst nake ku li seranserî rojê ve be û ku bikaribe beramberî heta bûyereke sportîf e.Ev zűbizű germê, ma sobayiyê neke û ne li ser cilên nemîne. Кирибо, bi awayên cuda nirxandin: кесек бехса со вкусом ягод джи, хинек дзи йен пир xweş, стандартная косметика ên bîhnxweş.
«Люмен». СС-крем. Дэн цзи ван кесен ку хин не рази ма
Эв би расти джи халетки удивительно, ку пир кэм комментарии критик е. Di nav wan de bi îdîaya biçûk ji cream dikare wiha da zanîn:
1. Do aborî ne. Ew pir çalak û bi çermê xwe de bihelînin û be réjhe zû xwarin. Дибе ку ев cihê ку бибе е, ди хеман деме де бухайе крем мекбул би ре шве би кар бин джи, ди пакиджи ди ку ту диксвази е.
2. Zextên çavi, heger gelek stûr, bi eksê belavkirin — обзоры wisa li ser background bi sedan pêşberî merheleyê nakevin. Dibe, ku ev berhemên ku bi eksê profîlek an sextekar e.
3. Ev dihêle û şopên li ser cilên. Ev li dijî обзоры, ku got: superstoykosti xwe ye.
4. Hin ji dem piştî ku sepan ji Guherandinên color li ser orange carrot-xwezayî û sedemên topped — wisa îdîaya li boriyê tenê yek vekişînê jî dikare bi nasnav û berhemên boborî daleqandiş jík jêk.
Tu dikarî din отзывы neyînî bibînin. li wir podkozhniki, pimples dilsoz — «Ez bi vî rengî çerm perfect şa bû, wek wî, min tune ne, her roj ew bi kar anîn, lê piştî çend mehan, di çerm de dianî, xerabtir bûimûne: Ji çi yek ji ladies e. Min heb, da ku bavêjin a krem û di çerm de ji bo demeke dirêj ji bo qenckirina û xemgîn. Ez li kompozîsyona nêrî — niha ez fêm çi yei. ji bo bikarhênerên ji rêzê û bloggerên ku bi hewl makeup cuda got, û ew tiştekî, чтобы сравнить крем SS «Lumen».
Отзывы о blogvan biyanî
Bi giştî, li cream derveyî gel e. Gel nivîsandinê ku ew bi temamî охватывает kêmasiyên xwe dinêre, pir xwezayî, non-pêgir на языке girêl çerm. Lê belê, gelek in, heta li отзывы erênî bi dezavantajên tê wateya ku ji bêalîbûnê ji yên weha re обзоры dipeyive nîşankirin. Ji bo nimûne, финиш пудровый bes ji bo çerm rûn, û bi giştî di yekem cream saetê de pir shiny e paşê sifrê rûniştî, pir dijwar ji bo hilbijartina rengê keçik bi çerm pir spîs (yeku blogger, Финляндия) ).Средний рейтинг li ser yek ji malperên yên отзывов biyanî — 4,4 xalan (67 отзывов), bi 85% ji dagir ev tool dîsa kirîn kirine. A encama baş!
wan ên ku wê hez nakim çi bikin? Pir zêde giran, pir grîng jî, jî orange — ew her tim li ser gilî çawa lady bi çerm pir tenik berfê-spî. Тайбетмендиен текникы йен ди хеман, би хему песне «Люмен» (крем СС). Deng ji xwediyên çerm kombînasyona bi taybetî girîng û krîtîk in: увлажняющий крем ew diherike, û bê drykuva krem û tundtir li rûyê.Rastî ew e ku ev pirsgirêk nikare bê çareserkirin: to bi baldarî amade çerm bi îmkanên ji gewdeya, û paşê bide cream nîv saetê ji bo biçûkbûna.
вебигухерин
Ev bi rastî jî pêngaveke ji brand budceya têr «Lumen» e. SS-крем, ку Avis би келекан зедетир джи йек джи весайита любит подобное, би расти джи хеджайи бале. kêmasiyên xwe yên marjînal e, û wek avahiya giran, ku hêja ye ji bîr nekin ku ev krem e lênêrîna pir ne, çawa ji bo afirandina bandoreke декоративный. Приставка Piştî SS wateya «контроль цвета».дзи бо афирандина лицо diger’in — ew e ku fonksiyona sereke ya van a berhemê ye. Вероятно, em hê jî li benda ji bo serbestberdana ji nifşê nû, ji kremên, wek DD, hê bêtir temam e bi rastî jî du, sê an çar Amûrên di yek.
«Люмен». СС-крем. Отзывы ку саабсан мид ка мид ах воскьяабаха кусуб ее угу гуулаха бадан
dadweynaha guud ayaa weli ma helin waqti si aad u hesho caajisin la kareemada BB intii dhigooda fiican — SS-kareemada (waayo, qorniinku воск soo socda ee alifbeetada).midab maqaarka Perfect aan saamayn maaskarada, isuga ugu fiican oo ka mid аh midabka maqaarka hooyo, fuuq, adayg iyo raaxo maalintii oo dhan — vacaa uu ballan qaaday in la abuuro a shirkadda «Lumen» SS-Lumen. Ответы исага ку саабсан савири фиикан иску, каас оо ку гулайсанин раадиная бадан оо габдхаха. Laakiin dhab ahaantii vaca uu leeyahay ma unu?
ra’yi-celin wanaagsan
cream waa fududahay in la isticmaalo: si fiican u qaybiyey wejiga, si fudud oo israac raacsan, dhammaataan dhe iyo xataa maqaarkcan ku wareegsayastagua ка, лаакиин папа бадан воскай ахаайен сидаас оо хорана от алаабта это в меэль иска дхигаан оо дхан хаб каадига ах).
In la texture cream aan caadi ahayn: marka hore, waa dareere ah oo si muuqata u iftiimaa daqiiqadii ugu horeysay ka dib markii codsi, laakiin markaas vaca uu noqonayaa mid aad u jilicsan iyo budada ah. Faa’iidada kale — Waxaa loo isticmaali karaa sida, корректор ах! Тусаале ахан, си ай у карияан касаан максалига ах, ваа в ад кодсато SS-крем «Люмен» калия милаха дхибаатада, си таксадар лех хадхка, оо воскаа ла дхаммаатаан иску дарсамаан макаркайс ноуаудашо ладаринь хадуаудаша дуаудана дошуааааааааааааааааааааааааааааааа, гудуаудахаа ладаринь «хадуаудахаааудаана» гудуаудаша дуаааа ан ла арки карин.Думар бадан, тусаале ахаан, ла макарка адка у мадоу ама аад у фудуд, каас оо вакти дхир ка хели ваайен хад сакса ах ее аасаска, угу данбейн хелай хабун в строке «Люмен». dib u eegista SS-cream qoran yihiin gabdho aad u kala duwan, si fiican islana kasta oo midab maqaarka shaqsi.
Waxaa la og yahay в khayraadka farqiga u fiican in ay ku riday on salka huurka ah, haddii kale vaca uu iftiimin doonaa oo dhan hoolmay iyo воск исдаба марин. SS-крем «Lumen», taas oo dib u eegista inta badan heysta dalashada in si fiican si ay ula qabsadaan oo ay qoyaan u gaar ah, xitaa воск яр сглаживает кабсатай.Тани воскаа лага арки караа в ку dhowaad dhammaan савиро ах. Isaga oo qudha waa awoodaa inuu bedelo saldhig u qurxiyo, консилер iyo aasaaskii ururka.
maqaarka hoostiisa kariimka ma dhididdaa, qalab aanu u baahan in la cusboonaysiiyo maalintii oo dhan iyo waa in ay u adkeysan xitaa ay dhacdo isboorti ah awood. Waxay u dul qaadasho kulaylka, ma dabaalan oo aanu jirin dhar ah. Ур воскаа лагу qiimeeyaa в siyaabo kala duwan: qof ka hadlayaa dhadhan ee berry, qaar ka mid ah arrin wacan, laakiin heerka cadar isku qurxiyo.
«Люмен». СС-крем. Джавааб-селинта ка мид ах кува велли ку каначсанайн
Ваксаа рутий ваа калаб ла яаб лех, таас оо аад у яр комментарии мухийм ах. Waxaa ka mid ah sheegashada yar in kariimka in la ogaadaa karaa sida soo socota:
1. Ha dhaqaale. Waxa uu aad u firfircoon uga nuugo maqaarka iyo xad si deg deg ah waa la wada baabbi’iyey. Waxaa laga yaabaa in tani meesha u noqon waa, laakiin qiimaha kariimka la aqbali karo inaad isu ogolaato inaad u isticmaali tiro ee aad rabto.
2. Isagoo carrabka ku daloolada, xad-dhaafka ah qaro weyn, si liidata loo qaybiyey — eegista sida ku saabsan asalka ah ee boqolaal ka soo hor jeedda eegi arrin lagu qanci karo. Waxaa laga yaabaa, waa воск soo saarka ah in si liidata loo kaydiyaa ama was.
3. Waxaa ka baxo raad on dhar ah. Тани ваа крышка ку ах диб у эгиста, каас оо шигай в суперстойкости ай.
4. Muddo ka dib codsiga ah ee isbedel color on orange karooto-dabiiciga ah iyo keentaa hoolmay — sheegashada sida ka dhawaajisay mid baxaan oo kaliya sidoo kale kula macaamiloodeen lagaa midi kadai xa был ах кариимка.
Waxaad ka heli kartaa dib u eegista kale negative. Waxaa podkozhniki, Finan xanuun badan — «Waxaan ahaa faraxsanahay maqaarka kaamil ah sida, isaga oo kale ah, ma aanan haysan, ay maalin kasta la isticmaalo, laakiin dhawr bilood, waqan ka muaqa xuaqan a xuaqan a xuaqan ayaqan ayaqan ваа воска мид ка мид ах хаакимки.Химия на кимистари! «Оо воскаа ло шигай в ан дадка истичмаала каадига ай йо ку кора кувас оо си джугто ай иску дайая курксийо кала дуван, оо воскей леейихин воск является варварским кремом SS Lumen.
Отзывы о qora shisheeye
Guud ahaan, cream waa caan dibadda. Dadka ku qor in ay si fiican u daboolaa qaladaadkeyga, u muuqataa mid aad u dabiiciga ah, не слеживается в laalaabkii maqaarka. Си кастаба ха ахатее, аад у тиро бадан, хатаа у ээгиста ванаагсан воскаа лагу калаамадейай хасараха хаб в ку хадла ее дхексдхексааднимада ее диб у еегиста сида.Тусаале ахан, будада ах ку дхамейстаан ку филан макар дуфан лех, йо гуд ахан в сливках угу хорейсай саачад ваа аррин дхалдхалаалаан оо маркаас фадхийа хос, куво кураг адаг ин ладорэто мидабка чахаду лахэгуэ гаэи ка мид блогер ка Финляндия). рейтинг Celceliska на мид ка мид ах губаха ее диб у эгиста арримаха дибадда — 4,4 дхибкуд (67 диб у эгиста), иядоо 85% иибсада соо иибсатай калаб этот мар кале. Natiijada A wanaagsan!
Maxaad samaynaysaan oo kuwa aan jeclahay? Аад у кулус, сиду кале дхагта, сиду кале апельсин — васкаа хад йо джеер ка кабан ку саабсан сида марвада ла макарка бараф-чад оо аад у дуубан.Sifooyinka farsamo oo ka mid ah isla, aan ammaantaada oo dhan, «Люмен» (крем SS). Джавааб-селинта ка молокилайаяаша макарка иску дафан си гаар ах мухийм: ширин усуу ла барваакайсан, оо ан джинайя крем йё адкееан веджига. Рунта воскса ай тахай в дхибаатада лагу халлин караа: си таксадар лех у дияарисо макарка тааси оо ка хоулмай, ка дибна си сливки ах нус саак ах яраншаха.
natiijooyinka
Waxaa run ahaantii waa horumar degdeg ах а ах ее бренд miisaaniyad ку филан «Люмен».SS-крем, каас оо диб у ээгис ку больше xamaasad бадан в воске каста оо рааксо ла мид ах, беги ахаанти ваа даринка качайа. ceebaha ay yihiin dayac badan, iyo sida qaab-dhismeedka culus, vaca haboon in la xasuusnaado in la xasuusnaado in cream tani ma aha daryeel aad u badan, sida in la abuuro saamayn madaxtooyada. Ka dib markii Horgalaha SS taasoo la micno ah «gacanta midabka». Taasi waa shaqo ugu weyn ee воск soo saarka noocan oo kale ah — in la abuuro muuqaal ah hufan. Малаха, воскан велли ку сугаин в ла сии даайо джиилка кусуб ее каримада, сида ДД ах, хатаа ка каамилсан, оо рунти ваа лаба, саддекс ама афар калаб ка мид ах.
Анализ результатов | Вводная психология
Знаете ли вы, что с увеличением продаж мороженого растет и общий уровень преступности? Возможно ли, что наслаждение любимым вкусом мороженого может спровоцировать преступление? Или, совершив преступление, вы думаете, что решите побаловать себя шишкой? Нет никаких сомнений в том, что между мороженым и преступностью существует связь (например, Harper, 2013), но было бы довольно глупо полагать, что одно на самом деле привело к другому.
Гораздо более вероятно, что и продажи мороженого, и уровень преступности связаны с температурой на улице. В жаркую погоду много людей выходит из домов, взаимодействует друг с другом, раздражается друг на друга, а иногда и совершает преступления. Кроме того, когда на улице тепло, мы с большей вероятностью будем искать прохладное угощение, например мороженое. Как определить, действительно ли существует связь между двумя вещами? А когда есть отношения, как мы можем определить, связано ли это совпадением или причинно-следственной связью?
Корреляция означает, что существует взаимосвязь между двумя или более переменными (например, потребление мороженого и преступность), но эта взаимосвязь не обязательно подразумевает причинно-следственную связь.Когда две переменные коррелированы, это просто означает, что при изменении одной переменной изменяется и другая. Мы можем измерить корреляцию, вычислив статистику, известную как коэффициент корреляции. Коэффициент корреляции — это число от -1 до +1, которое указывает силу и направление взаимосвязи между переменными. Коэффициент корреляции обычно обозначается буквой r .
Числовая часть коэффициента корреляции указывает на силу взаимосвязи.Чем ближе число к 1 (отрицательное или положительное), тем сильнее взаимосвязаны переменные и тем более предсказуемыми будут изменения одной переменной по мере изменения другой переменной. Чем ближе число к нулю, тем слабее взаимосвязь и тем менее предсказуемой становится взаимосвязь между переменными. Например, коэффициент корреляции 0,9 указывает на гораздо более сильную взаимосвязь, чем коэффициент корреляции 0,3. Если переменные вообще не связаны друг с другом, коэффициент корреляции равен 0.Приведенный выше пример о мороженом и преступности — это пример двух переменных, которые, как мы могли бы ожидать, никак не связаны друг с другом.
Знак — положительный или отрицательный — коэффициента корреляции указывает направление взаимосвязи ([ссылка]). Положительная корреляция означает, что переменные движутся в одном направлении. Другими словами, это означает, что по мере увеличения одной переменной увеличивается и другая, и наоборот, когда одна переменная уменьшается, увеличивается и другая. Отрицательная корреляция означает, что переменные движутся в противоположных направлениях.Если две переменные имеют отрицательную корреляцию, уменьшение одной переменной связано с увеличением другой и наоборот.
Пример мороженого и уровня преступности — положительная корреляция, потому что обе переменные увеличиваются при повышении температуры. Другими примерами положительной корреляции являются взаимосвязь между ростом и весом человека или взаимосвязь между возрастом человека и количеством морщин. Можно ожидать, что существует отрицательная корреляция между усталостью человека в течение дня и количеством часов, в течение которых он спал предыдущей ночью: количество сна уменьшается по мере нарастания чувства усталости.На реальном примере отрицательной корреляции студенты-исследователи из Университета Миннесоты обнаружили слабую отрицательную корреляцию ( r = -0,29) между средним количеством дней в неделю, в течение которых студенты спали менее 5 часов, и их средним баллом. (Лоури, Дин и Мандерс, 2010 г.). Имейте в виду, что отрицательная корреляция — это не то же самое, что отсутствие корреляции. Например, мы, вероятно, не найдем корреляции между количеством часов сна и размером обуви.
Как упоминалось ранее, корреляции имеют прогностическое значение.Представьте, что вы входите в приемную комиссию крупного университета. Вы сталкиваетесь с огромным количеством заявок, но вы можете удовлетворить лишь небольшой процент от общего числа соискателей. Как вы можете решить, кого следует принять? Вы можете попытаться сопоставить текущий средний балл успеваемости учащихся в колледже с их результатами по стандартным тестам, таким как SAT или ACT. Наблюдая за тем, какие корреляции были наиболее сильными для ваших нынешних студентов, вы могли бы использовать эту информацию для прогнозирования относительного успеха тех студентов, которые подали заявление о приеме в университет.
Диаграммы рассеяния — это графическое представление силы и направления корреляций. Чем сильнее корреляция, тем ближе точки данных к прямой линии. В этих примерах мы видим, что существует (а) положительная корреляция между весом и ростом, (б) отрицательная корреляция между усталостью и продолжительностью сна и (в) отсутствие корреляции между размером обуви и продолжительностью сна.
Ссылка на обучение
Управляйте этой интерактивной диаграммой рассеяния, чтобы попрактиковаться в понимании положительной и отрицательной корреляции.
Корреляция не указывает причинно-следственную связь
Корреляционное исследование полезно, потому что оно позволяет нам обнаружить силу и направление взаимосвязей, существующих между двумя переменными. Однако корреляция ограничена, поскольку установление наличия связи мало что говорит нам о причине и следствии. Хотя переменные иногда коррелируют, потому что одно действительно вызывает другое, также может быть, что какой-то другой фактор, смешивающая переменная, на самом деле вызывает систематическое движение в наших интересующих переменных.В примере с мороженым и уровнем преступности, упомянутом ранее, температура является смешивающей переменной, которая может объяснить взаимосвязь между двумя переменными.
Даже когда мы не можем указать на устранение смешивающих переменных, мы не должны предполагать, что корреляция между двумя переменными подразумевает, что одна переменная вызывает изменения в другой. Это может расстраивать, когда причинно-следственная связь кажется ясной и интуитивно понятной. Вернемся к нашему обсуждению исследований, проведенных Американским онкологическим обществом, и того, что их исследовательские проекты были одними из первых демонстраций связи между курением и раком.Кажется разумным предположить, что курение вызывает рак, но если бы мы ограничились корреляционными исследованиями, мы бы вышли за наши границы, сделав это предположение.
К сожалению, люди все время ошибочно утверждают, что причинная связь является функцией корреляций. Такие утверждения особенно часто встречаются в рекламе и новостях. Например, недавнее исследование показало, что люди, которые регулярно едят злаки, достигают более здорового веса, чем те, кто редко ест злаки (Frantzen, Treviño, Echon, Garcia-Dominic, & DiMarco, 2013; Barton et al., 2005). Угадайте, как зерновые компании сообщают об этом открытии. Действительно ли употребление хлопьев способствует поддержанию здорового веса у человека, или есть другие возможные объяснения, например, тот, кто имеет здоровый вес, с большей вероятностью будет регулярно есть здоровый завтрак, чем тот, кто страдает ожирением, или кто-то, кто пытается избежать приема пищи. на диету ([ссылка])? Хотя корреляционные исследования неоценимы для выявления взаимосвязей между переменными, основным ограничением является невозможность установить причинно-следственную связь.Психологи хотят делать утверждения о причине и следствии, но единственный способ сделать это — провести эксперимент, чтобы ответить на исследовательский вопрос. В следующем разделе описывается, как научные эксперименты включают методы, которые исключают или контролируют альтернативные объяснения, что позволяет исследователям исследовать, как изменения в одной переменной вызывают изменения в другой переменной.
Действительно ли употребление хлопьев способствует поддержанию здорового веса? (кредит: Тим Скиллерн)
Иллюзорные корреляции
Соблазн сделать ошибочные причинно-следственные утверждения на основе корреляционных исследований — не единственный способ неверной интерпретации данных.Мы также склонны ошибаться в иллюзорных корреляциях, особенно с бессистемными наблюдениями. Иллюзорные корреляции или ложные корреляции возникают, когда люди верят, что отношения существуют между двумя вещами, хотя таких отношений не существует. Одна хорошо известная иллюзорная корреляция — это предполагаемое влияние лунных фаз на человеческое поведение. Многие люди страстно утверждают, что на человеческое поведение влияет фаза луны, и в частности, что люди странно себя ведут в полнолуние ([ссылка]).
Многие люди считают, что полная луна заставляет людей вести себя странно. (Кредит: Кори Занкер)
Нельзя отрицать, что Луна оказывает сильное влияние на нашу планету. Приливы и отливы в океане тесно связаны с гравитационными силами Луны. Поэтому многие люди считают логичным, что Луна также влияет на нас. В конце концов, наши тела в значительной степени состоят из воды. Однако метаанализ почти 40 исследований последовательно продемонстрировал, что взаимосвязи между луной и нашим поведением не существует (Роттон и Келли, 1985).Хотя мы можем уделять больше внимания странному поведению во время полной фазы луны, частота странного поведения остается постоянной на протяжении всего лунного цикла.
Почему мы так склонны верить в подобные иллюзорные корреляции? Часто мы читаем или слышим о них и просто принимаем информацию как достоверную. Или у нас есть догадка о том, как что-то работает, а затем мы ищем доказательства, подтверждающие эту догадку, игнорируя доказательства, которые говорят нам, что наша догадка ложна; это известно как предвзятость подтверждения. В других случаях мы находим иллюзорные корреляции, основанные на информации, которая легче всего приходит в голову, даже если эта информация сильно ограничена.И хотя мы можем быть уверены, что можем использовать эти отношения для лучшего понимания и предсказания мира вокруг нас, иллюзорные корреляции могут иметь существенные недостатки. Например, исследования показывают, что иллюзорные корреляции — при которых определенное поведение неверно приписывается определенным группам — участвуют в формировании предвзятого отношения, которое в конечном итоге может привести к дискриминационному поведению (Fiedler, 2004).
Как вы уже знаете, единственный способ установить причинно-следственную связь между двумя переменными — это провести научный эксперимент.В научном контексте эксперимент имеет иное значение, чем в повседневной жизни. В повседневном разговоре мы часто используем его, чтобы описать попытку чего-то впервые, например экспериментировать с новой прической или новой едой. Однако в научном контексте эксперимент имеет четкие требования к разработке и реализации.
Экспериментальная гипотеза
Чтобы провести эксперимент, исследователь должен иметь определенную гипотезу, которую нужно проверить. Как вы узнали, гипотезы можно сформулировать либо путем непосредственного наблюдения за реальным миром, либо после тщательного анализа предыдущих исследований.Например, если вы считаете, что детям нельзя разрешать смотреть передачи по телевидению, связанные с насилием, потому что это заставит их вести себя более агрессивно, то вы в основном сформулировали гипотезу, а именно, что просмотр телевизионных программ с насилием заставляет детей вести себя более агрессивно. . Как вы могли прийти к этой конкретной гипотезе? У вас могут быть более молодые родственники, которые смотрят мультфильмы, в которых персонажи используют боевые искусства, чтобы спасти мир от злодеев, с впечатляющим набором ударов руками, ногами и защитными позами.Вы замечаете, что, посмотрев какое-то время эти передачи, ваши молодые родственники имитируют боевое поведение персонажей, изображенных в мультфильме ([ссылка]).
Наблюдение за таким поведением сразу после того, как ребенок смотрит телепрограммы с насилием, может привести вас к гипотезе о том, что просмотр телепрограмм с насилием приводит к увеличению проявления агрессивного поведения. (кредит: Эмран Кассим)
Именно такие личные наблюдения часто приводят нас к формулированию конкретной гипотезы, но мы не можем использовать ограниченные личные наблюдения и анекдотические свидетельства для тщательной проверки нашей гипотезы.Вместо этого, чтобы узнать, подтверждают ли реальные данные нашу гипотезу, мы должны провести эксперимент.
Планирование эксперимента
Самый простой экспериментальный план включает две группы: экспериментальную группу и контрольную группу. Эти две группы созданы так, чтобы быть одинаковыми, за исключением одного различия — экспериментальной манипуляции. Экспериментальная группа получает экспериментальную манипуляцию, то есть исследуемое лечение или переменную (в данном случае, телевизионные изображения насилия), а контрольная группа — нет.Поскольку экспериментальные манипуляции — единственное различие между экспериментальной и контрольной группами, мы можем быть уверены, что любые различия между ними вызваны экспериментальными манипуляциями, а не случайностью.
В нашем примере того, как телепрограммы с насилием могут повлиять на насильственное поведение детей, экспериментальная группа просматривает телепрограммы с насилием в течение определенного времени, а затем измеряет их агрессивное поведение. Мы измеряем агрессивное поведение в нашей контрольной группе после того, как они смотрят ненасильственные телепрограммы в течение того же времени.Важно, чтобы с контрольной группой обращались так же, как с экспериментальной группой, за исключением того, что контрольная группа не подвергается экспериментальным манипуляциям. Поэтому у нас есть контрольная группа, которая смотрит ненасильственные телепрограммы столько же времени, что и экспериментальная группа.
Нам также необходимо точно определить или ввести в действие то, что считается насильственным и ненасильственным. Оперативное определение — это описание того, как мы будем измерять наши переменные, и оно важно для того, чтобы позволить другим точно понять, как и что исследователь измеряет в конкретном эксперименте.При реализации насильственного поведения мы можем считать примерами такого поведения только физические действия, такие как удары ногой или кулаком, или мы также можем включить гневные словесные обмены. Что бы мы ни определяли, важно, чтобы мы применяли насильственное поведение таким образом, чтобы любой, кто впервые слышит о нашем исследовании, точно знал, что мы подразумеваем под насилием. Это помогает людям интерпретировать наши данные, а также повторять наш эксперимент, если они захотят это сделать.
После того, как мы определили, что считается насильственным телевизионным программированием и что считается агрессивным поведением участников нашего эксперимента, нам нужно определить, как мы будем проводить наш эксперимент. В этом случае мы могли бы попросить участников посмотреть 30-минутную телевизионную программу (насильственную или ненасильственную, в зависимости от принадлежности к группе), прежде чем отправить их на игровую площадку на час, где наблюдают за их поведением, а также за количеством и типом насильственных действий. записывается.
В идеале люди, которые наблюдают и записывают поведение детей, не знают, кто был отнесен к экспериментальной или контрольной группе, чтобы избежать предвзятости экспериментатора. Предвзятость экспериментатора относится к возможности того, что ожидания исследователя могут исказить результаты исследования. Помните, что проведение эксперимента требует тщательного планирования, и люди, участвующие в исследовательском проекте, кровно заинтересованы в подтверждении своих гипотез. Если бы наблюдатели знали, какой ребенок был в какой группе, это могло бы повлиять на то, сколько внимания они уделяли поведению каждого ребенка, а также на то, как они интерпретировали это поведение.Не обращая внимания на то, какой ребенок к какой группе принадлежит, мы защищаемся от этих предубеждений. Эта ситуация представляет собой одинарное слепое исследование, означающее, что одна из групп (участников) не знает, в какую группу они входят (экспериментальная или контрольная), в то время как исследователь, разработавший эксперимент, знает, какие участники входят в каждую группу.
В двойном слепом исследовании и исследователи, и участники не понимают групповых заданий. Зачем исследователю проводить исследование, в котором никто не знает, кто принадлежит к какой группе? Потому что, поступая так, мы можем контролировать ожидания как экспериментатора, так и участника.Если вы знакомы с фразой «эффект плацебо», вы уже имеете некоторое представление о том, почему это важно. Эффект плацебо возникает, когда ожидания или убеждения людей влияют или определяют их опыт в данной ситуации. Другими словами, простое ожидание того, что что-то произойдет, действительно может заставить это случиться.
Эффект плацебо обычно описывают с точки зрения тестирования эффективности нового лекарства. Представьте, что вы работаете в фармацевтической компании и думаете, что у вас есть новое лекарство, эффективное при лечении депрессии.Чтобы продемонстрировать эффективность вашего лекарства, вы проводите эксперимент с двумя группами: экспериментальная группа получает лекарство, а контрольная группа — нет. Но вы не хотите, чтобы участники знали, получили они лекарство или нет.
Почему? Представьте, что вы участник этого исследования и только что приняли таблетку, которая, по вашему мнению, улучшит ваше настроение. Поскольку вы ожидаете, что таблетка окажет действие, вы можете почувствовать себя лучше просто потому, что вы приняли таблетку, а не из-за какого-либо лекарства, фактически содержащегося в таблетке — это эффект плацебо.
Чтобы убедиться, что любое воздействие на настроение вызвано препаратом, а не ожиданиями, контрольная группа получает плацебо (в данном случае сахарную пилюлю). Теперь каждый получает таблетку, и снова ни исследователь, ни участники эксперимента не знают, кто получил лекарство, а кто сахарную таблетку. Любые различия в настроении между экспериментальной и контрольной группами теперь можно отнести к самому препарату, а не к предвзятости экспериментатора или ожиданиям участников ([ссылка]).
Предоставление контрольной группе лечения плацебо защищает от предвзятости, вызванной ожиданием.(кредит: Элейн и Артур Шапиро)
Независимые и зависимые переменные
В рамках исследовательского эксперимента мы стремимся изучить, вызывают ли изменения в одной вещи изменения в другой. Чтобы достичь этого, мы должны обращать внимание на две важные переменные или вещи, которые могут быть изменены в любом экспериментальном исследовании: независимая переменная и зависимая переменная. Независимой переменной манипулирует или контролирует экспериментатор. В хорошо спланированном экспериментальном исследовании независимая переменная является единственным важным различием между экспериментальной и контрольной группами.В нашем примере того, как жестокие телевизионные программы влияют на проявление детьми агрессивного поведения, независимой переменной является тип программы — насильственный или ненасильственный — просматриваемый участниками исследования ([ссылка]). Зависимая переменная — это то, что исследователь измеряет, чтобы увидеть, какое влияние оказала независимая переменная. В нашем примере зависимой переменной является количество насильственных действий, продемонстрированных участниками эксперимента.
Ожидается, что в эксперименте манипуляции с независимой переменной приведут к изменениям в зависимой переменной.(кредит «автомат»: модификация работы Дэниела Ойнса; кредит «игрушечный пистолет»: модификация работы Эмрана Кассима)
Мы ожидаем, что зависимая переменная изменится как функция независимой переменной. Другими словами, зависимая переменная зависит от независимой переменной. Хороший способ подумать о взаимосвязи между независимыми и зависимыми переменными — это вопрос: какое влияние независимая переменная оказывает на зависимую переменную? Возвращаясь к нашему примеру, как влияет получасовой просмотр телепрограмм с насилием или ненасильственных телепрограмм на количество случаев физической агрессии на игровой площадке?
Выбор и назначение участников эксперимента
Теперь, когда наше исследование разработано, нам нужно получить выборку людей для включения в наш эксперимент.В нашем исследовании участвуют люди, поэтому нам нужно определить, кого включить. Участники являются объектами психологического исследования, и, как следует из названия, люди, участвующие в психологическом исследовании, активно участвуют в этом процессе. Часто в проектах психологических исследований участвуют студенты колледжей. Фактически, подавляющее большинство исследований в подобластях психологии исторически вовлекали студентов в качестве участников (Sears, 1986; Arnett, 2008). Но действительно ли студенты колледжей представляют собой население в целом? Студенты колледжей, как правило, моложе, образованнее, либеральнее и менее разнообразны, чем население в целом.Хотя использование студентов в качестве испытуемых является общепринятой практикой, полагаться на такой ограниченный круг участников исследования может быть проблематично, поскольку трудно обобщить результаты на более широкую популяцию.
В нашем гипотетическом эксперименте участвуют дети, и сначала мы должны создать выборку детей-участников. Выборки используются, потому что популяции обычно слишком велики, чтобы разумно вовлечь каждого члена в наш конкретный эксперимент ([ссылка]). Если возможно, мы должны использовать случайную выборку (существуют и другие типы выборок, но для целей этой главы мы сосредоточимся на случайных выборках).Случайная выборка — это подмножество более широкой совокупности, в которой каждый член совокупности имеет равные шансы быть выбранным. Случайные выборки предпочтительнее, потому что, если выборка достаточно велика, мы можем быть разумно уверены, что участвующие люди являются репрезентативными для большей популяции. Это означает, что процентное соотношение характеристик в выборке — пол, этническая принадлежность, социально-экономический уровень и любые другие характеристики, которые могут повлиять на результаты, — близки к процентному содержанию в большей популяции.
В нашем примере предположим, что мы решили, что нас интересуют четвероклассники. Но все четвероклассники — это очень большая популяция, поэтому мы должны быть более конкретными; вместо этого мы могли бы сказать, что нас интересуют все четвероклассники в определенном городе. Мы должны включать студентов из разных категорий доходов, семейного положения, расы, этнической принадлежности, религии и географических районов города. Имея это более управляемое население, мы можем работать с местными школами, выбирая случайную выборку из примерно 200 четвероклассников, которых мы хотим принять участие в нашем эксперименте.
Таким образом, поскольку мы не можем протестировать всех четвероклассников в городе, мы хотим найти группу из примерно 200 человек, которая отражает состав этого города. Имея репрезентативную группу, мы можем обобщить наши результаты на более широкую популяцию, не опасаясь того, что наша выборка будет каким-либо образом предвзята.
Исследователи могут работать с (а) большой популяцией или (б) выборочной группой, которая является подмножеством большей популяции. (кредит «толпа»: модификация работы Джеймса Кридленда; кредит «студенты»: модификация работы Лори Салливан)
Теперь, когда у нас есть выборка, следующим шагом экспериментального процесса является разделение участников на экспериментальную и контрольную группы путем случайного распределения.При случайном распределении все участники имеют равные шансы попасть в любую группу. Существует статистическая программа, которая случайным образом распределяет каждого четвероклассника из выборки в экспериментальную или контрольную группу.
Случайное распределение имеет решающее значение для правильного планирования эксперимента. При достаточно больших выборках случайное распределение делает маловероятным наличие систематических различий между группами. Так, например, очень маловероятно, что мы получим одну группу, состоящую исключительно из мужчин, определенной этнической принадлежности или данной религиозной идеологии.Это важно, потому что, если бы группы были систематически разными до начала эксперимента, мы не знали бы происхождения каких-либо различий, которые мы обнаруживаем между группами: были ли различия существующими ранее или они были вызваны манипуляциями с независимой переменной? Случайное распределение позволяет предположить, что любые различия, наблюдаемые между экспериментальной и контрольной группами, являются результатом манипулирования независимой переменной.
Ссылка на обучение
Используйте этот онлайн-инструмент, чтобы мгновенно генерировать случайные числа и узнать больше о случайной выборке и назначениях.
Вопросы для рассмотрения
Хотя эксперименты позволяют ученым делать причинно-следственные утверждения, они не лишены проблем. Настоящие эксперименты требуют от экспериментатора манипулирования независимой переменной, а это может усложнить многие вопросы, на которые психологи могут захотеть ответить. Например, представьте, что вы хотите знать, какое влияние пол (независимая переменная) оказывает на пространственную память (зависимая переменная). Хотя вы, безусловно, можете искать различия между мужчинами и женщинами в задаче, которая затрагивает пространственную память, вы не можете напрямую контролировать пол человека.Мы классифицируем этот тип исследовательского подхода как квазиэкспериментальный и признаем, что в этих обстоятельствах мы не можем делать причинно-следственные утверждения.
Экспериментаторы также ограничены этическими ограничениями. Например, вы не сможете провести эксперимент, призванный определить, приводит ли насилие в детстве к снижению самооценки взрослых. Чтобы провести такой эксперимент, вам нужно будет случайным образом распределить некоторых участников эксперимента в группу, которая подвергается насилию, и этот эксперимент будет неэтичным.
Интерпретация результатов экспериментов
После сбора данных как из экспериментальной, так и из контрольной групп проводится статистический анализ, чтобы выяснить, есть ли значимые различия между двумя группами. Статистический анализ определяет, насколько вероятно, что любое обнаруженное различие вызвано случайностью (и, следовательно, не имеет смысла). В психологии групповые различия считаются значимыми или значимыми, если вероятность того, что эти различия возникли случайно, составляет 5 процентов или меньше.Другими словами, если мы повторим этот эксперимент 100 раз, мы ожидаем получить те же результаты по крайней мере 95 раз из 100.
Самая большая сила экспериментов — это способность утверждать, что любые существенные различия в результатах вызваны независимой переменной. Это происходит потому, что случайный выбор, случайное назначение и план, ограничивающий влияние как предвзятости экспериментатора, так и ожидания участников, должны создавать группы, похожие по составу и лечению.Следовательно, любое различие между группами можно отнести к независимой переменной, и теперь мы можем, наконец, сделать причинно-следственное утверждение. Если мы обнаружим, что просмотр телепрограммы с насилием приводит к более агрессивному поведению, чем просмотр ненасильственной программы, мы можем с уверенностью сказать, что просмотр телепрограмм с насилием вызывает усиление проявления насильственного поведения.
Отчетные исследования
Когда психологи завершают исследовательский проект, они обычно хотят поделиться своими открытиями с другими учеными.Американская психологическая ассоциация (APA) издает руководство, в котором подробно описывается, как написать статью для отправки в научные журналы. В отличие от статьи, которая может быть опубликована в журнале, подобном Psychology Today, , который нацелен на широкую аудиторию, интересующуюся психологией, научные журналы обычно публикуют рецензируемые журнальные статьи, предназначенные для аудитории профессионалов и ученых, активно участвующих в исследованиях. сами себя.
Ссылка на обучение
Онлайн-лаборатория письма (OWL) в Университете Пердью поможет вам ознакомиться с правилами написания APA.
Рецензируемую журнальную статью читают несколько других ученых (как правило, анонимно), имеющих опыт в предметной области. Эти рецензенты предоставляют отзывы — как автору, так и редактору журнала — о качестве черновика. Рецензенты ищут убедительное обоснование описываемого исследования, четкое описание того, как проводилось исследование, и доказательства того, что исследование проводилось с соблюдением этических норм. Они также ищут недостатки в дизайне, методах и статистических анализах исследования.Они проверяют, что выводы, сделанные авторами, кажутся разумными с учетом наблюдений, сделанных в ходе исследования. Рецензенты также отмечают, насколько ценно исследование для углубления знаний в данной дисциплине. Это помогает предотвратить ненужное дублирование результатов исследований в научной литературе и, в некоторой степени, гарантирует, что каждая исследовательская статья содержит новую информацию. В конечном итоге редактор журнала соберет все отзывы рецензентов и определит, будет ли статья опубликована в ее текущем состоянии (что бывает редко), опубликована с исправлениями или не будет принята к публикации.
Рецензирование обеспечивает определенную степень контроля качества психологического исследования. Плохо задуманные или выполненные исследования можно отсеять, и даже хорошо спланированные исследования можно улучшить с помощью предложенных изменений. Рецензирование также гарантирует, что исследование достаточно четко описано, чтобы позволить другим ученым воспроизвести его, то есть они могут повторить эксперимент, используя другие образцы, чтобы определить надежность. Иногда репликации включают дополнительные меры, которые расширяют исходный результат.В любом случае каждая репликация служит для получения дополнительных доказательств в поддержку исходных результатов исследования. Успешное тиражирование опубликованных исследований делает ученых более склонными к принятию этих результатов, в то время как повторяющиеся неудачи, как правило, ставят под сомнение легитимность исходной статьи и заставляют ученых искать в другом месте. Например, было бы большим достижением в области медицины, если бы опубликованное исследование показало, что прием нового лекарства помогает людям достичь здорового веса без изменения своего рациона.Но если бы другие ученые не смогли воспроизвести результаты, утверждения исходного исследования были бы поставлены под сомнение.
Копай глубже: миф о вакцине-аутизме и отзыв опубликованных исследований
Некоторые ученые утверждали, что обычные детские вакцины вызывают у некоторых детей аутизм, и, фактически, в нескольких рецензируемых публикациях были опубликованы исследования, подтверждающие эти утверждения. После первых отчетов крупномасштабные эпидемиологические исследования показали, что вакцинация не вызывает аутизма и что гораздо безопаснее сделать вакцинацию вашему ребенку, чем нет.Кроме того, с тех пор были отозваны несколько оригинальных исследований, в которых делалось это утверждение.
Опубликованная работа может быть аннулирована, если данные ставятся под сомнение из-за фальсификации, фальсификации или серьезных проблем с дизайном исследования. После аннулирования научное сообщество информируется о серьезных проблемах с оригинальной публикацией. Отзыв может быть инициирован исследователем, руководившим исследованием, сотрудниками по исследованию, учреждением, нанявшим исследователя, или редакционной коллегией журнала, в котором статья была первоначально опубликована.В случае вакцины-аутизма отказ был сделан из-за значительного конфликта интересов, в котором ведущий исследователь имел финансовую заинтересованность в установлении связи между детскими вакцинами и аутизмом (Offit, 2008). К сожалению, первоначальные исследования привлекли такое внимание средств массовой информации, что многие родители во всем мире не решались делать прививки своим детям ([ссылка]). Для получения дополнительной информации о том, как развивалась история с вакциной и аутизмом, а также о последствиях этой истории, взгляните на книгу Пола Оффита « Ложные пророки аутизма: плохая наука, рискованная медицина и поиск лекарства».
Некоторые люди до сих пор считают, что прививки вызывают аутизм. (кредит: модификация работы UNICEF Sverige)
Корреляция описывается коэффициентом корреляции r , который находится в диапазоне от -1 до 1. Коэффициент корреляции говорит нам о природе (положительной или отрицательной) и силе связи между двумя или более переменными. Корреляции ничего не говорят нам о причинно-следственной связи, независимо от того, насколько сильна связь между переменными.Фактически, единственный способ продемонстрировать причинно-следственную связь — это провести эксперимент. Люди часто делают ошибку, утверждая, что корреляции существуют, хотя на самом деле их нет.
Исследователи могут проверять причинно-следственные гипотезы путем проведения экспериментов. В идеале участники эксперимента выбираются случайным образом из интересующей популяции. Затем участники случайным образом распределяются по соответствующим группам. Иногда исследователь и участники не видят членства в группе, чтобы их ожидания не влияли на результаты.
В идеальном дизайне эксперимента единственная разница между экспериментальной и контрольной группами заключается в том, подвергаются ли участники экспериментальным манипуляциям. Каждая группа проходит все фазы эксперимента, но каждая группа испытает различный уровень независимой переменной: экспериментальная группа подвергается экспериментальной манипуляции, а контрольная группа не подвергается экспериментальной манипуляции. Затем исследователь измеряет изменения, которые производятся в зависимой переменной в каждой группе.После того, как данные собраны из обеих групп, они анализируются статистически, чтобы определить, есть ли значимые различия между группами.
Психологи публикуют результаты своих исследований в рецензируемых журнальных статьях. Исследования, опубликованные в этом формате, проверяются несколькими другими психологами, которые служат фильтром, отделяющим идеи, подтверждаемые доказательствами, от идей, которые не подтверждаются. Репликация играет важную роль в обеспечении легитимности опубликованных исследований. В конечном итоге только те открытия, которые можно постоянно тиражировать, достигнут консенсуса в научном сообществе.
Обзор, применение, побочные эффекты, меры предосторожности, взаимодействия, дозировка и отзывы
Александракис, М., Летурно, Р., Кемпурадж, Д., Кандере-Гжибовска, К., Хуанг, М., Христодулу, С., Буше , W., Seretakis, D., и Theoharides, TC Flavones ингибируют пролиферацию и увеличивают содержание медиатора в лейкозных тучных клетках человека (HMC-1). Eur.J Haematol. 2003; 71 (6): 448-454. Просмотреть аннотацию.
Битти, Э. Р., О’Рейли, Дж. Д., Англия, Т. Г., Маканлис, Г. Т., Янг, И. С., Гайсслер, К.А., Сандерс Т. А. и Вайзман Х. Влияние диетического кверцетина на окислительное повреждение ДНК у здоровых людей. Br J Nutr 2000; 84 (6): 919-925. Просмотреть аннотацию.
Boots, A. W., Haenen, G. R. и Bast, A. Влияние кверцетина на здоровье: от антиоксиданта до нутрицевтика. Eur.J Pharmacol 5-13-2008; 585 (2-3): 325-337. Просмотреть аннотацию.
Чопра М., Фитцсимонс П. Э., Стрейн Дж. Дж., Турнем Д. И. и Ховард А. Н. Безалкогольный экстракт красного вина и кверцетин ингибируют окисление ЛПНП, не влияя на концентрацию антиоксидантных витаминов и каротиноидов в плазме.Clin.Chem. 2000; 46 (8 Pt 1): 1162-1170. Просмотреть аннотацию.
Crespy, V., Morand, C., Manach, C., Besson, C., Demigne, C., и Remesy, C. Часть кверцетина, абсорбированная в тонком кишечнике, конъюгируется и далее секретируется в просвет кишечника. Am J Physiol 1999; 277 (1, часть 1): G120-G126. Просмотреть аннотацию.
de Vries, JH, Hollman, PC, Meyboom, S., Buysman, MN, Zock, PL, van Staveren, WA, и Katan, MB Концентрации в плазме и экскреция с мочой антиоксидантных флавонолов, кверцетина и кемпферола в качестве биомаркеров при потреблении с пищей .Am.J Clin Nutr. 1998; 68 (1): 60-65. Просмотреть аннотацию.
Дхар, Н. Б. и Шоскес, Д. А. Новые методы лечения хронического простатита. Curr.Urol.Rep. 2007; 8 (4): 313-318. Просмотреть аннотацию.
Egert, S., Wolffram, S., Bosy-Westphal, A., Boesch-Saadatmandi, C., Wagner, AE, Frank, J., Rimbach, G., and Mueller, MJ Daily, добавление кверцетина в зависимости от дозы увеличивает концентрацию кверцетина в плазме у здоровых людей. J Nutr 2008; 138 (9): 1615-1621. Просмотреть аннотацию.
Эрлунд, И., Alfthan, G., Maenpaa, J. и Aro, A. Чай и ишемическая болезнь сердца: флавоноид кверцетин более биодоступен из рутина у женщин, чем у мужчин. Arch.Intern.Med. 8-13-2001; 161 (15): 1919-1920. Просмотреть аннотацию.
Гуглер Р., Лешик М. и Денглер Х. Дж. Распределение кверцетина у человека после однократного перорального и внутривенного введения. Eur.J.Clin.Pharmacol. 12-19-1975; 9 (2-3): 229-234. Просмотреть аннотацию.
Havsteen, B. Флавоноиды, класс натуральных продуктов с высокой фармакологической активностью.Biochem.Pharmacol 4-1-1983; 32 (7): 1141-1148. Просмотреть аннотацию.
Холлман, П. К., де Фрис, Дж. Х., ван Лиувен, С. Д., Менгелерс, М. Дж. И Катан, М. Б. Поглощение пищевых гликозидов кверцетина и кверцетина у здоровых добровольцев после илеостомии. Am.J.Clin.Nutr. 1995; 62 (6): 1276-1282. Просмотреть аннотацию.
Холлман, П. К., ван Трайп, Дж. М., Менгелерс, М. Дж., Де Фрис, Дж. Х. и Катан, М. Б. Биодоступность диетического антиоксиданта флавонола кверцетина у человека. Cancer Lett. 3-19-1997; 114 (1-2): 139-140.Просмотреть аннотацию.
Холлман, П.С., Бийсман, Миннесота, ван Гамерен, И., Кноссен, Е.П., де Фрис, Дж. Х., и Катан, МБ. Фрагмент сахара является основным определяющим фактором абсорбции флавоноидных гликозидов с пищей у человека. Free Radic.Res. 1999; 31 (6): 569-573.
Kang, LP, Qi, LH, Zhang, JP, Shi, N., Zhang, M., Wu, TM и Chen, J. Влияние генистеина и кверцетина на пролиферацию, синтез коллагена и уровни мРНК проколлагена I типа звездчатых клеток печени крыс. Acta Pharmacol.Sin.2001; 22 (9): 793-796. Просмотреть аннотацию.
Ламсон, Д. В. и Бриньял, М. С. Антиоксиданты и рак, часть 3: кверцетин. Altern.Med.Rev. 2000; 5 (3): 196-208. Просмотреть аннотацию.
Лок, У. М., Ходжсон, Дж. М., Праудфут, Дж. М., Мак-Кинли, А. Дж., Падди, И. Б. и Крофт, К. Д. Чистые диетические флавоноиды, кверцетин и (-) — эпикатехин, увеличивают количество продуктов оксида азота и резко снижают уровень эндотелина-1 у здоровых мужчин. Am J Clin Nutr 2008; 88 (4): 1018-1025. Просмотреть аннотацию.
Майер, Б., Шумахер, М., Brandstatter, H., Wagner, F. S. и Hermetter, A. Высокопроизводительный флуоресцентный скрининг антиоксидантной способности в сыворотке крови человека. Анал Биохим 10-15-2001; 297 (2): 144-153. Просмотреть аннотацию.
McAnulty, SR, McAnulty, LS, Nieman, DC, Quindry, JC, Hosick, PA, Hudson, MH, Still, L., Henson, DA, Milne, GL, Morrow, JD, Dumke, CL, Utter, AC , Triplett, NT, и Dibarnardi, A. Хроническое употребление кверцетина и вызванное физическими упражнениями окислительное повреждение и воспаление.Приложение Physiol Nutr Metab 2008; 33 (2): 254-262. Просмотреть аннотацию.
Мураками А., Ашида Х. и Терао Дж. Многоцелевая профилактика рака с помощью кверцетина. Cancer Lett. 10-8-2008; 269 (2): 315-325. Просмотреть аннотацию.
Ниман, Д. К. Иммунное питание спортсменов. Nutr.Rev. 2008; 66 (6): 310-320. Просмотреть аннотацию.
Райалам С., Делла-Фера М. А. и Байле С. А. Фитохимические вещества и регуляция жизненного цикла адипоцитов. J Nutr Biochem. 2008; 19 (11): 717-726. Просмотреть аннотацию.
Терао, Дж., Каваи, Ю. и Мурота, К. Растительные флавоноиды и сердечно-сосудистые заболевания. Азиатско-Тихоокеанский регион. J. Clin Nutr 2008; 17 Приложение 1: 291-293. Просмотреть аннотацию.
Валле Т., Валле У. К. и Галушка П. В. Двуокись углерода является основным метаболитом кверцетина у людей. J.Nutr. 2001; 131 (10): 2648-2652. Просмотреть аннотацию.
Wiczkowski, W., Romaszko, J., Bucinski, A., Szawara-Nowak, D., Honke, J., Zielinski, H., and Piskula, MK Кверцетин из лука-шалота (Allium cepa L. var. Aggregatum) более биодоступен, чем его глюкозиды.J Nutr 2008; 138 (5): 885-888. Просмотреть аннотацию.
Young, JF, Nielsen, SE, Haraldsdottir, J., Daneshvar, B., Lauridsen, ST, Knuthsen, P., Crozier, A., Sandstrom, B., and Dragsted, LO Влияние потребления фруктового сока на мочеиспускание экскреция кверцетина и биомаркеры антиоксидантного статуса. Am J Clin Nutr 1999; 69 (1): 87-94. Просмотреть аннотацию.
Аренс М.Дж., Томпсон Д.Л. Влияние эмулина на уровень глюкозы в крови у диабетиков 2 типа. J Med Food. 2013; 16 (3): 211-5. Просмотреть аннотацию.
Аноним.Кверцетин. Alt Med Rev 1998; 3: 140-3.
Bazzucchi I, Patrizio F, Ceci R, et al. Добавка кверцетина улучшает восстановление нервно-мышечной функции после повреждения мышц. Питательные вещества. 2020; 12 (9): E2850. Просмотреть аннотацию.
Bazzucchi I, Patrizio F, Ceci R, et al. Влияние добавок кверцетина на повреждение мышц, вызванное эксцентрическими упражнениями. Питательные вещества. 2019; 11 (1). pii: E205. Просмотреть аннотацию.
Бедада С.К., Нирати П. Оценка эффекта лечения кверцетином на ферментативную активность диклофенака CYP2C9 у здоровых добровольцев.Phytother Res. 2018 Февраль; 32 (2): 305-311. DOI: 10.1002 / ptr.5978. Просмотреть аннотацию.
Bhutani P, Rajanna PK, Paul AT. Влияние кверцетина на фармакокинетику кветиапина: выводы исследований in vivo на крысах линии Wistar. Xenobiotica. 2020: 1-7. Просмотреть аннотацию.
Bobe G, Weinstein SJ, Albanes D, et al. Потребление флавоноидов и риск рака поджелудочной железы у курящих мужчин (Финляндия). Эпидемиологические биомаркеры рака до 2008 г .; 17: 553-62. Просмотреть аннотацию.
Cesarone MR, Belcaro G, Hu S, et al.Дополнительная профилактика и лечение астмы с помощью фитосом кверцетина: пилотный реестр. Минерва Мед 2019; 110 (6): 524-9. Просмотреть аннотацию.
Choi JS, Choi BC, Choi KE. Влияние кверцетина на фармакокинетику циклоспорина перорально. Am J Health Syst Pharm 2004; 61: 2406-9. Просмотреть аннотацию.
Чой Дж. С., Джо Б. В., Ким Ю. Повышенная биодоступность паклитаксела после перорального введения паклитаксела или пролекарства крысам, предварительно получавшим кверцетин. Eur J Pharm Biopharm 2004; 57: 313-8. Просмотреть аннотацию.
Conquer JA, Maiani G, Azzini E, et al. Добавление кверцетина заметно увеличивает концентрацию кверцетина в плазме, не влияя на отдельные факторы риска сердечных заболеваний у здоровых людей. J Nutr 1998; 128: 593-7. Просмотреть аннотацию.
de Pascual-Teresa S, Johnston KL, DuPont MS, et al. Метаболиты кверцетина подавляют транскрипцию циклооксигеназы-2 в лимфоцитах человека ex vivo, но не in vivo. J Nutr 2004; 134: 552-7. Просмотреть аннотацию.
de Vries JH, Hollman PC, van Amersfoort I, et al.Красное вино — плохой источник биодоступных флавонолов для мужчин. J Nutr 2001; 131: 745-8. Просмотреть аннотацию.
Ди Бари Л., Риполи С., Прадхан С., Сальвадори П. Взаимодействие между кверцетином и варфарином для связывания альбумина: новый взгляд на вмешательство пищи / лекарств. Хиральность 2010; 22: 593-6. Просмотреть аннотацию.
DiCenzo R, Frerichs V, Larppanichpoonphol P, et al. Влияние кверцетина на плазменные и внутриклеточные концентрации саквинавира у здоровых взрослых. Фармакотерапия 2006; 26: 1255-61.Просмотреть аннотацию.
Дуань К.М., Ван С.Ю., Оуян З., Мао Ю.М., Ян Л.Дж. Влияние кверцетина на активность CYP3A у здоровых китайских участников. J Clin Pharmacol 2012; 52 (6): 940-6. Просмотреть аннотацию.
Эдвардс Р.Л., Лион Т., Литвин С.Е. и др. Кверцетин снижает артериальное давление у гипертоников. J Nutr 2007; 137: 2405-11. Просмотреть аннотацию.
El Attar TM, Virji AS. Модулирующее действие ресвератрола и кверцетина на рост и пролиферацию раковых клеток полости рта. Противораковые препараты 1999; 10: 187-93.Просмотреть аннотацию.
Эрлунд I, Фриз Р., Марниеми Дж. И др. Биодоступность кверцетина из ягод и диет. Nutr Cancer 2006; 54: 13-7. Просмотреть аннотацию.
Эрлунд I, Косонен Т., Альфтан Г. и др. Фармакокинетика кверцетина из кверцетин-агликона и рутина у здоровых добровольцев. Eur J Clin Pharmacol 2000; 56: 545-53 .. Просмотреть аннотацию.
Ферри Д.Р., Смит А., Малханди Дж. И др. Фаза I клинических испытаний флавоноида кверцетина: фармакокинетика и доказательства ингибирования тирозинкиназы in vivo.Clin Cancer Res 1996; 2: 659-67 .. Просмотреть аннотацию.
Gates MA, Tworoger SS, Hecht JL, et al. Проспективное исследование потребления флавоноидов с пищей и заболеваемости эпителиальным раком яичников. Int J Cancer 2007; 121: 2225-32. Просмотреть аннотацию.
Голдберг Д.М., Ян Дж., Солеас Дж. Поглощение трех полифенолов, связанных с вином, в трех различных матрицах здоровыми субъектами. Clin Biochem 2003; 36: 79-87 .. Просмотреть аннотацию.
Guo Y, Mah E, Davis CG, et al. Диетический жир увеличивает биодоступность кверцетина у взрослых с избыточным весом.Mol Nutr Food Res 2013; 57 (5): 896-905. Просмотреть аннотацию.
Hamdy AA, Ibrahem MA. Лечение афтозных язв с помощью местного кверцетина: рандомизированное клиническое исследование. J Contemp Dent Pract. 2010; 11 (4): E009-16. Просмотреть аннотацию.
Harwood M, Danielewska-Nikiel B, Borzelleca JF, et al. Критический обзор данных, касающихся безопасности кверцетина и отсутствия доказательств токсичности in vivo, включая отсутствие генотоксических / канцерогенных свойств. Food Chem Toxicol 2007; 45: 2179-205.Просмотреть аннотацию.
Heinz SA, Henson DA, Austin MD, Jin F, Nieman DC. Добавки кверцетина и инфекции верхних дыхательных путей: рандомизированное клиническое исследование в сообществе. Pharmacol Res. 2010; 62 (3): 237-42. Просмотреть аннотацию.
Hertog MG, Feskens EJ, Hollman PC, et al. Диетические антиоксидантные флавоноиды и риск ишемической болезни сердца: исследование пожилых людей Zutphen. Ланцет 1993; 342: 1007-1011. Просмотреть аннотацию.
Хуанг Х., Ляо Д., Донг И, Пу Р. Влияние добавок кверцетина на липидные профили плазмы, артериальное давление и уровни глюкозы: систематический обзор и метаанализ.Nutr Rev.2020; 78 (8): 615-626. Просмотреть аннотацию.
Хуанг З., Фаско М.Дж., Каминский Л.С. Ингибирование эстронсульфатазы в микросомах печени человека кверцетином и другими флавоноидами. Дж. Стероид Биохим Мол Биол 1997; 63: 9-15. Просмотреть аннотацию.
Хаббард Г.П., Вольфрам С., Лавгроув Дж. А., Гиббинс Дж. М.. Прием кверцетина подавляет агрегацию тромбоцитов и основные компоненты стимулируемого коллагеном пути активации тромбоцитов у людей. Дж. Тромб Хемост 2004; 2: 2138-45. Просмотреть аннотацию.
Янссен К., Менсинк Р.П., Кокс Ф.Дж. и др.Влияние флавоноидов кверцетина и апигенина на гемостаз у здоровых добровольцев: результаты исследования in vitro и диетических добавок. Am J Clin Nutr 1998; 67: 255-62. Просмотреть аннотацию.
Джавади Ф., Ахмадзаде А., Эгтесади С. и др. Влияние кверцетина на воспалительные факторы и
клинические симптомы у женщин с ревматоидным артритом: двойное слепое рандомизированное контролируемое исследование. J Am Coll Nutr. 2017; 36 (1): 9-15.
Просмотреть аннотацию.
Хоршиди М., Мойни А., Алипур Э. и др.Влияние добавок кверцетина на метаболические и гормональные параметры, а также концентрацию в плазме и экспрессию гена резистина у женщин с избыточным весом или ожирением с синдромом поликистозных яичников. Phytother Res. 2018; 32 (11): 2282-2289. Просмотреть аннотацию.
Ким К.А., Пак П.В., Ким Х.К. и др. Влияние кверцетина на фармакокинетику розиглитазона, субстрата CYP2C8, у здоровых людей. J Clin Pharmacol 2005; 45: 941-6. Просмотреть аннотацию.
Knab AM, Shanely RA, Jin F, Austin MD, Sha W, Nieman DC.Кверцетин с витамином С и ниацином не влияет на массу или состав тела. Appl Physiol Nutr Metab. 2011; 36 (3): 331-8. Просмотреть аннотацию.
Кога Т., Мейдани М. Влияние плазменных метаболитов (+) — катехина и кверцетина на адгезию моноцитов к эндотелиальным клеткам аорты человека. Am J Clin Nutr 2001; 73: 941-8 .. Просмотреть аннотацию.
Кушьяр М.М., Мозафари П.М., Амирчагмаги М. и др. Рандомизированное плацебо-контролируемое двойное слепое клиническое исследование кверцетина в профилактике и лечении мукозита полости рта, вызванного химиотерапией.J Clin Diagn Res. 2017; 11 (3): ZC46-ZC50. Просмотреть аннотацию.
Куо С.М., Ливитт П.С., Лин С.П. Пищевые флавоноиды взаимодействуют с микроэлементами металлов и влияют на уровень металлотионеина в клетках кишечника человека. Biol Trace Elem Res 1998; 62: 135-53. Просмотреть аннотацию.
Ларсон А., Уитман М.А., Го Й и др. Острое вызванное кверцетином снижение артериального давления у лиц с гипертонией не является вторичным по отношению к снижению активности ангиотензинпревращающего фермента плазмы или эндотелин-1: оксида азота. Nutr Res.2012; 32 (8): 557-64. Просмотреть аннотацию.
Lean ME, Noroozi M, Kelly I. Диетические флавонолы защищают диабетические лимфоциты человека от окислительного повреждения ДНК. Диабет 1999; 48: 176-81. Просмотреть аннотацию.
Li C, Wang X, Bi Y и др. Сильные ингибиторы переносчиков органических анионов 1 и 3 из природных соединений и их защитное действие при нефропатии, связанной с аристолоховой кислотой. Toxicol Sci. 2020; 175 (2): 279-291. Просмотреть аннотацию.
Марселья Г., Ликари А., Леонарди С. и др. Полицентрическое рандомизированное исследование в параллельных группах многокомпонентного нутрицевтика Lertal® в качестве профилактического лечения детей с аллергическим риноконъюнктивитом: фаза II.Ital J Pediatr. 2019; 45 (1): 84. Просмотреть аннотацию.
McAnlis GT, McEneny J, Pearce J, Young IS. Всасывание и антиоксидантные эффекты кверцетина из лука у человека. Eur J Clin Nutr 1999; 53: 92-6. Просмотреть аннотацию.
Miodini P, Fioravanti L, Di Fronzo G, Cappelletti V. Два фитоэстрогена, генистеин и кверцетин, по-разному влияют на функцию рецепторов эстрогена. Br J Cancer 1999; 80: 1150-5. Просмотреть аннотацию.
Мурота К., Терао Дж. Антиоксидантный флавоноид кверцетин: влияние его кишечной абсорбции и метаболизма.Arch Biochem Biophys 2003; 417: 12-7. Просмотреть аннотацию.
Nemeth K, Piskula MK. Пищевой состав, переработка, всасывание и метаболизм флавоноидов лука. Crit Rev Food Sci Nutr 2007; 47: 397-409. Просмотреть аннотацию.
Nguyen MA, Staubach P, Wolffram S, Langguth P. Влияние однократного и краткосрочного введения кверцетина на фармакокинетику талинолола у людей — значение для оценки опосредованных переносчиком взаимодействий флавоноидов с лекарственными средствами. Eur J Pharm Sci 2014; 61: 54-60.Просмотреть аннотацию.
Ni Y, Duan Z, Zhou D, et al. Идентификация структурных особенностей для ингибирования опосредованного OAT3 поглощения эналаприлата выбранными лекарственными средствами и флавоноидами. Front Pharmacol. 2020; 11: 802. Просмотреть аннотацию.
Ниман Д.К., Хенсон Д.А., Дэвис Дж. М. и др. Прием кверцетина не влияет на изменения цитокинов у спортсменов, участвующих в беге на выносливость в западных штатах. J. Interferon Cytokine Res 2007; 27: 1003-11. Просмотреть аннотацию.
Ниман, округ Колумбия, Хенсон Д.А., Дэвис Дж. М. и др.Влияние кверцетина на вызванные физической нагрузкой изменения цитокинов плазмы и мРНК мышечных и лейкоцитарных цитокинов. J Appl Physiol 2007; 103: 1728-35. Просмотреть аннотацию.
Ниман, округ Колумбия, Хенсон Д.А., Гросс С.Дж. и др. Кверцетин уменьшает болезни, но не снижает иммунные нарушения после интенсивных упражнений. Med Sci Sports Exerc 2007; 39: 1561-9. Просмотреть аннотацию.
Нисидзима Т., Такида Ю., Сайто Ю., Икеда Т., Иваи К. Одновременное употребление пектина с высоким содержанием метоксигрупп из яблока может улучшить абсорбцию кверцетина у людей.Br J Nutr. 2015 28 мая; 113 (10): 1531-8. Просмотреть аннотацию.
Nöthlings U, Murphy SP, Wilkens LR, et al. Флавонолы и риск рака поджелудочной железы: многоэтническое когортное исследование. Am J Epidemiol 2007; 166: 924-31. Просмотреть аннотацию.
Obach RS. Ингибирование ферментов цитохрома P450 человека компонентами зверобоя, растительного препарата, используемого при лечении депрессии. J. Pharmacol Exp Ther 2000; 294: 88-95. Просмотреть аннотацию.
Ostadmohammadi V, Milajerdi A, Ayati E, Kolahdooz F, Asemi Z.Влияние добавок кверцетина на гликемический контроль у пациентов с метаболическим синдромом и связанными с ним расстройствами: систематический обзор и метаанализ рандомизированных контролируемых исследований. Phytother Res 2019; 33 (5): 1330-40. Просмотреть аннотацию.
Otsuka H, Inaba M, Fujikura T, Kunitomo M. Гистохимические и функциональные характеристики метахроматических клеток в носовом эпителии при аллергическом рините: исследования соскобов из носа и их рассеянных клеток. J. Allergy Clin Immunol. 1995; 96: 528-36.. Просмотреть аннотацию.
Ou Q, Zheng Z, Zhao Y, Lin W. Влияние кверцетина на системные уровни воспаления: метаанализ рандомизированных контролируемых испытаний на людях. Int J Food Sci Nutr. 2020; 71 (2): 152-163. Просмотреть аннотацию.
Palleschi G, Carbone A, Ripoli A, et al. Проспективное исследование для оценки эффективности Cistiquer в улучшении симптомов со стороны нижних мочевыводящих путей у женщин с уретральным синдромом. Минерва Урол Нефрол. 2014; 66 (4): 225-32. Просмотреть аннотацию.
Пеллетье DM, Lacerte G, Goulet ED.Влияние добавок кверцетина на выносливость и максимальное потребление кислорода: метаанализ. Int J Sport Nutr Exerc Exerc Metab 2013; 23 (1): 73-82. Просмотреть аннотацию.
Перес-Вискаино Ф., Дуарте Дж., Андрианциохайна Р. Эндотелиальная функция и сердечно-сосудистые заболевания: эффекты кверцетина и полифенолов вина. Free Radic Res 2006; 40: 1054-65. Просмотреть аннотацию.
Рачкаускас Г.С. Эффективность энтеросорбции и комбинации антиоксидантов у шизофреников. Лик Справа 1998; 4: 122-4.Просмотреть аннотацию.
Резван Н., Мойни А., Джанани Л. и др. Влияние кверцетина на адипонектин-опосредованную чувствительность к инсулину при синдроме поликистозных яичников: рандомизированное плацебо-контролируемое двойное слепое клиническое исследование. Horm Metab Res. 2017; 49 (2): 115-121. Просмотреть аннотацию.
Riva A, Ronchi M, Petrangolini G, Bosisio S, Allegrini P. Улучшенное пероральное всасывание кверцетина из Quercetin Phytosome®, новой системы доставки на основе лецитина пищевого качества. Eur J Drug Metab Pharmacokinet 2019; 44 (2): 169-77.Просмотреть аннотацию.
Сахебкар А. Влияние добавок кверцетина на липидный профиль: систематический обзор и метаанализ рандомизированных контролируемых исследований. Crit Rev Food Sci Nutr. 2017; 57 (4): 666-676. Просмотреть аннотацию.
Саджади Хезаве З., Азаркиван А., Джанани Л., Хоссейни С., Шидфар Ф. Влияние кверцетина на перегрузку железом и воспаление у пациентов с большой ß-талассемией: двойное слепое рандомизированное клиническое исследование. Дополнение Ther Med 2019; 46: 24-8. Просмотреть аннотацию.
Serban MC, Sahebkar A, Zanchetti A, et al; Группа сотрудничества по метаанализу липидов и артериального давления (LBPMC).Влияние кверцетина на артериальное давление: систематический обзор и метаанализ рандомизированных контролируемых исследований. J Am Heart Assoc. 2016; 5 (7). pii: e002713. Просмотреть аннотацию.
Сесинк А.Л., О’Лири К.А., Холлман ПК. Глюкурониды кверцетина, но не глюкозиды, присутствуют в плазме человека после употребления кверцетин-3-глюкозида или кверцетин-4′-глюкозида. J Nutr 2001; 131: 1938-41 .. Просмотреть аннотацию.
Шарп М.А., Хендриксон Н.Р., Стааб Дж. С. и др. Влияние кратковременного приема кверцетина на характеристики солдат.J Strength Cond Res 2012; 26 Приложение 2: S53-60. Просмотреть аннотацию.
Shoskes D, Lapierre C, Cruz-Corerra M, et al. Благоприятное влияние биофлавоноидов куркумина и кверцетина на раннюю функцию при трансплантации трупной почки: рандомизированное плацебо-контролируемое исследование. Трансплантация 2005; 80: 1556-9. Просмотреть аннотацию.
Shoskes DA, Zeitlin SI, Shahed A, Rajfer J. Кверцетин у мужчин с хроническим простатитом III категории: предварительное проспективное двойное слепое плацебо-контролируемое исследование.Урол 1999; 54: 960-3. Просмотреть аннотацию.
Starvic B. Кверцетин в нашем рационе: от сильнодействующего мутагена до вероятного антиканцерогена. Clin Biochem 1994; 27: 245-8.
Suardi N, Gandaglia G, Nini A, et al. Влияние Дифапроста на дисфункцию мочеиспускания, гистологию и маркеры воспаления у пациентов с доброкачественной гиперплазией предстательной железы, которые являются кандидатами на хирургическое лечение. Минерва Урол Нефрол. 2014; 66 (2): 119-25. Просмотреть аннотацию.
Талиу А., Зинцарас Е., Ликурас Л., Фрэнсис К.Открытое пилотное исследование состава, содержащего противовоспалительный флавоноид лютеолин, и его влияние на поведение детей с расстройствами аутистического спектра. Clin Ther. 2013; 35 (5): 592-602. Просмотреть аннотацию.
Торелла М., Дель Део Ф, Гримальди А. и др. Эффективность пероральной комбинации гиалуроновой кислоты, хондроитинсульфата, куркумина и кверцетина для профилактики рецидивирующих инфекций мочевыводящих путей у женщин в постменопаузе. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 2016; 207: 125-128.Просмотреть аннотацию.
Вацлавикова Р., Хорски С., Симек П., Гут И. Метаболизм паклитаксела в микросомах печени крысы и человека ингибируется фенольными антиоксидантами. Наунин Шмидебергс Arch Pharmacol 2003; 368: 200-9. Просмотреть аннотацию.
Висенте-Висенте Л., Гонсалес-Калле Д., Казанова А.Г. и др. Кверцетин — многообещающий клинический кандидат для профилактики контрастно-индуцированной нефропатии. Международный журнал научных исследований, 2019; 20 (19): 4961. Просмотреть аннотацию.
Walle T, Otake Y, Walle UK, Wilson FA. Глюкозиды кверцетина полностью гидролизуются у пациентов с илеостомией перед абсорбцией.J Nutr 2000; 130: 2658-61 .. Просмотреть аннотацию.
Ван С.Ю., Дуан К.М., Ли И и др. Влияние кверцетина на транспортную способность P-гликопротеина у здоровых китайцев. Eur J Clin Nutr 2013; 67 (4): 390-4. Просмотреть аннотацию.
Уайзман Х. Биодоступность непитательных растительных факторов: пищевых флавоноидов и фитоэстрогенов. Proc Nutr Soc 1999; 58: 139-46. Просмотреть аннотацию.
Woo HD, Ким Дж. Потребление флавоноидов с пищей и связанный с курением риск рака: метаанализ. PLoS One.2013; 8 (9): e75604. Просмотреть аннотацию.
Wu LX, Guo CX, Chen WQ и др. Ингибирование органического анион-транспортирующего полипептида 1B1 кверцетином: оценка in vitro и in vivo. Br J Clin Pharmacol 2012; 73 (5): 750-7. Просмотреть аннотацию.
Zhao Q, Wei J, Zhang H. Влияние кверцетина на фармакокинетику лозартана и его метаболита EXP3174 у крыс. Xenobiotica 2019; 49 (5): 563-8. Просмотреть аннотацию.
Перегородчатые структуры апикальной мембраны между гепатоцитами необходимы для анизотропного расширения просвета и морфогенеза ткани печени.
Резюме
Полярность клеток является ключом к организации эпителия.В то время как поляризованные эпителиальные клетки имеют одну апико-базальную ось, гепатоциты проявляют сложную многоосевую полярность. Во время развития апикальные поверхности гепатоцитов анизотропно удлиняются, создавая трехмерную канальцевую сеть желчных канальцев (BC). Здесь, чтобы выяснить механизмы полярности гепатоцитов и преобразовать ее в простую эпителиальную полярность, мы оптимизировали систему культивирования первичных гепатобластов мыши, которая воспроизводит дифференцировку гепатоцитов и морфогенез BC. Примечательно, что мы обнаружили паттерн специфических расширений апикальной мембраны, запечатанных плотными соединениями, пересекающими просвет между двумя соседними гепатоцитами, которые напоминают переборки лодок.Эти апикальные переборки наблюдались также в развивающейся печени. Скрининг молекулярных факторов, необходимых для полярности гепатоцитов, показал, что молчание Rab35 вызывает потерю переборок, преобразование в простую полярность, образование цистоподобных структур и изменение судьбы клеток. Используя истощение Rab35 в развивающейся печени, мы можем реконструировать полярность гепатоцитов и запустить формирование эпителиальных трубок. Наши результаты предполагают новую модель морфогенеза РМЖ, основанную на механической стабилизации просвета канальцев.
Введение
Эпителиальные трубки являются важными компонентами нескольких органов, таких как почки и кишечник. Они состоят из клеток, которые проявляют апико-базальную полярность, причем апикальная поверхность обращена к внутреннему просвету , а базальная поверхность контактирует с базальной мембраной (Andrew and Ewald, 2010; Bryant and Mostov, 2008). Печень содержит два типа эпителиальных клеток, клетки желчных протоков (холангиоциты) и гепатоциты, оба происходят из эмбриональных предшественников, называемых гепатобластами (Müsch, 2018).Клетки желчных протоков представляют собой кубовидные или столбчатые эпителиальные клетки с типичной апико-базальной полярностью и апикальными поверхностями, имеющими общий просвет (Boyer, 2013; Treyer & Müsch, 2013). Гепатоциты, наиболее многочисленные эпителиальные клетки паренхимы печени, обладают особой полярностью, которую нельзя описать, используя только одну апико-базальную ось, как в простом эпителии (Treyer & Müsch, 2013). Гепатоциты многополярны с биаксиальной полярностью, характеризующейся двумя нематическими осями (Morales-Navarrete et al., 2019). In vivo , каждый гепатоцит обращен к синусоидальному эндотелию через несколько базальных доменов и может инициировать апикальный просвет с несколькими соседними гепатоцитами. В развивающейся печени просвет гепатоцитов анизотропно удлинен в виде трубчатого пояса, окружающего клетки, пересекая контактные мембраны между двумя соседними гепатоцитами (латеральный домен). Просвет в конечном итоге соединяется между собой, образуя сложную трехмерную люминальную сеть сильно разветвленных желчных каналов (BC) толщиной ~ 1 мкм (Morales-Navarrete et al., 2015). Функция BC — транспортировать желчь, секретируемую апикальной поверхностью гепатоцитов, к желчным протокам. Поток желчи через КМ поддерживается осмотическим давлением, но также значительным вкладом актомиозин-зависимой сократимости (Meyer et al., 2017; Watanabe et al., 1991). Однако тот факт, что такая сократимость не вызывает перистальтических движений, вызывает недоумение и требует механистического объяснения.
Организация и функция ткани печени, таким образом, зависят от генерации простой эпителиальной полярности vs.полярность гепатоцитов и их результирующая морфология просвета, механизмы которой до конца не изучены (Gissen and Arias, 2015; Müsch, 2014, 2018; Ober and Lemaigre, 2018; Tanimizu and Mitaka, 2017). В культурах 3D in vitro клетки желчных протоков образуют сферические кисты с полым просветом, подобные хорошо изученной клеточной системе MDCK (O’Brien et al., 2002; Tanimizu et al., 2007). С другой стороны, гепатоциты могут поляризоваться и образовывать BC-подобные структуры in vitro (Fu et al., 2010; Zeigerer et al., 2017). Интересно, что сверхэкспрессия Par1b в клетках MDCK изменяет ориентацию веретена и приводит к реорганизации просвета так, что они напоминают таковые у гепатоцитов. И наоборот, подавление Par1b в клеточных линиях гепатоцитов (HepG2 и WIF9B) переориентирует микротрубочки, как в эпителиальных клетках, что приводит к простой апико-базальной полярности (Cohen et al., 2004b, 2004a; Lázaro-Diéguez et al., 2013 ; Slim et al., 2013). Однако эти исследования проводились на клеточных линиях гепатоцитов, которые не повторяют специфическую морфологию удлиненных канальцев BC, а скорее образуют латеральный сферический просвет (Cohen et al., 2004b; де Марко и др., 2002). Механизмы, лежащие в основе морфогенеза удлиненной и разветвленной морфологии РМЖ, все еще остаются неясными (Fu et al., 2010, 2011; Li et al., 2016).
На раннем этапе развития (E13-14 у мышей и крыс) кластеры гепатоцитов генерируют небольшие отдельные сферические просветы, которые в конечном итоге соединяются в непрерывную сеть, одновременно с выходом гемопоэтических предшественников из печени (E17-21) (Ober and Lemaigre, 2018; Tanimizu, Mitaka, 2016; Treyer, Müsch, 2013).Основываясь на исследованиях in vitro, с использованием клеточных линий гепатоцитов или первичных гепатоцитов, Tanimizu и Mitaka (2017) обосновали модель, в которой деление клеток является ключевым фактором удлинения апикального просвета. Согласно этой модели, активно пролиферирующие гепатоциты плода изменяют способ деления клеток. На первом этапе гепатоциты делятся асимметрично и образуют разные просветы с соседними гепатоцитами (Overeem et al., 2015). Если деление клеток симметрично, например при истощении Par1b клетки разделяют один и тот же просвет, образуя кисту (Slim et al., 2013). На втором этапе гепатоциты ориентируют свое веретено перпендикулярно оси просвета и подвергаются неполному делению, которое предотвращает разделение просвета между двумя дочерними клетками, что приводит к удлинению первоначального сферического просвета в типичный каналец BC (Tanimizu and Mitaka, 2017; Wang et al. др., 2014). Однако в развивающейся печени по мере того, как гепатобласты дифференцируются в гепатоциты, они постепенно прекращают пролиферировать, уменьшаясь с 25% деления на E14.5 до большей части покоя на E17.5 (Yang et al., 2017). Тем не менее, между E14.5 и E17.5 небольшой изолированный апикальный просвет расширяется и генерирует почти полностью связанную сеть BC (Tanimizu et al., 2016; см. Ниже рис. 7C). Это означает, что фетальным гепатоцитам необходимы дополнительные механизмы, независимые от клеточного деления, для удлинения РМЖ, которые не могут быть захвачены клеточными линиями или модельными системами зрелых гепатоцитов.
Мы можем представить себе модель, в которой просвет удлиняется за счет анизотропного натяжения апикальной плазматической мембраны. Трубчатые структуры в других системах, таких как, например, трахейная трубка Drosophila, обладают периодическим надклеточным паттерном актина (Hannezo et al., 2015; Hayashi and Dong, 2017), которые могут помочь стабилизировать просвет гепатоцитов по мере их удлинения и предотвратить изотропное расширение. На сегодняшний день мало что известно о генерации и удлинении апикального просвета гепатоцитов (Li et al., 2016; Müsch, 2018; Ober and Lemaigre, 2018; Tanimizu and Mitaka, 2017).
В этом исследовании мы использовали культуры первичных гепатобластов мышей, чтобы выяснить механизмы, лежащие в основе анизотропного расширения апикального просвета для образования BC. Нам удалось реорганизовать полярность гепатоцитов и преобразовать ее в полярность простых эпителиальных клеток, создав эпителиальные трубки вместо БК в развивающейся эмбриональной печени.
Результаты
Морфогенез просвета в гепатоцитах сопровождается специфическими актиновыми структурами, которые соединяют две просветообразующие клетки
Чтобы понять, как поляризуются гепатоциты с образованием апикального просвета трубчатой формы, мы использовали хорошо зарекомендовавшую себя культуру первичных мышей. гепатобласты, выделенные из эмбриональной печени на основе экспрессии Dlk (Tanimizu et al., 2003), но оптимизированные условия (методы), чтобы дифференцировать их в гепатоциты и генерировать BC in vitro (рисунок 1A).Гепатобласты образовали удлиненные и разветвленные трубчатые просветы, обогащенные F-актином и положительные по апикальному маркеру CD13 и белку плотных контактов ZO-1 (рис. 1В). Таким образом, эта система повторяет образование разветвленного BC-lumina in vitro , аналогичного развивающейся печени in vivo . Дифференциация гепатоцитов была подтверждена профилированием экспрессии генов. Мы использовали RNA-seq для сравнения изолированных гепатобластов, in vitro, дифференцированных гепатоцитов и зрелых гепатоцитов, выделенных из печени взрослых в качестве контроля. In vitro дифференцированные гепатоциты подавляли маркер гепатобласта Dlk и повышали экспрессию генов в зрелых гепатоцитах, например метаболические гены, такие как Tat, G6pc, Pck1, Cyp3a11 (рис. 1C).
Рисунок 1: Морфогенез просвета в гепатоцитах сопровождается специфическими структурами актина, которые соединяют две просветообразующие клетки (см. Также рисунок S1)
A) Схематический обзор первичных Dlk + гепатобластов в сэндвич-культуре Matrigel, дифференцирующихся в гепатоциты и воспроизводящих образование BC .
B) Дифференцированные гепатоциты образуют разветвленные взаимосвязанные просветы BC. Изображения иммунофлуоресцентной микроскопии дифференцированных гепатоцитов, окрашенных на F-актин с помощью Phalloidin-Alexa488 и на апикальные маркеры CD13 и ZO-1. Шкала шкалы: 10 мкм.
C) In vitro дифференцированные гепатоциты экспрессируют маркеры зрелых гепатоцитов и подавляют маркер гепатобласта Dlk. Тепловая карта, сравнивающая экспрессию выбранных маркерных генов гепатоцитов в первичных Dlk + гепатобластах (гепатобластах), in vitro, дифференцированных гепатоцитах (Diff.гепатоциты) и контрольные зрелые гепатоциты, выделенные из печени взрослых мышей (зрелые гепатоциты). Эксперимент RNA-seq в 4 биологических повторностях.
D) Изображения с покадровой микроскопии живых клеток, документирующие образование BC между двумя дифференцирующимися гепатобластами, экспрессирующими LifeAct-EGFP. Во время визуализации расширяющийся трубчатый просвет показал выпуклость через 27 часов от начала визуализации, которая впоследствии была «повторно поглощена». На вставке D ’ показаны отдельные кадры, снятые каждые 10 минут с этого момента времени, документирующие восстановление канальца (белая звездочка).Обратите внимание на поперечный полосатый рисунок в каналах светлого поля и актина, который очевиден, когда просвет трубчатый, но не наблюдается внутри выпуклости. Шкала шкалы: 10 мкм. См. Также видео рисунок 1D (шкала: 10 мкм).
E) Изображение с помощью микроскопии локализации одной молекулы (SMLM) просвета между двумя дифференцированными гепатоцитами, актином, меченным Phalloidin-Alexa647. Обратите внимание на поперечный полосатый рисунок актина. Шкала шкалы: 5 мкм.
Для изучения морфогенеза просвета мы выполнили покадровую микроскопию живых клеток дифференцирующихся гепатобластов, стабильно экспрессирующих LifeAct-EGFP в качестве актиновой метки.Мы проследили люменогенез в течение 52 часов с 10-минутными интервалами и разделили четыре последовательных этапа:
1) начало просвета, 2) удлинение, 3) ветвление и 4) слияние. Мы часто наблюдали одиночные клетки, инициирующие несколько отдельных просветов со своими соседями (рисунок S1A, видео рисунок S1A). Интересно, что такая множественность просветов образовывалась независимо от деления клеток. Это обычное явление, потому что делящиеся клетки наблюдались редко. После образования просвет удлинился в трубки, пока они не охватили весь межклеточный контакт (Figure 1D, S1A, S1B, S1C, Videos Figure 1D, S1A, S1B, S1C).На этом этапе просвет может сливаться с другим просветом (Рисунок S1B, панели слева), разветвляясь на трехэлементном контакте (Рисунок S1B, панели справа).
Удлинение просвета в отсутствие деления клеток предполагает наличие анизотропных сил. Интересно, что мы также наблюдали случаи, когда просвет временно приобретал округлую форму (Рисунок 1D, Рисунок S1C, Видео Рисунок 1D, S1C), но эти структуры не расширялись изотропно, чтобы сформировать сферический просвет. Впоследствии они были «скорректированы», что свидетельствует о существовании механизмов контроля, которые активно усиливают анизотропию для предотвращения образования кистоподобных структур, типичных для эпителиальных клеток (Bryant, Mostov, 2008).
Нас заинтриговало присутствие темных полос в светлом поле, поперечном направлению удлинения просвета (например, рис. 1D, S1), что может соответствовать высокой кривизне апикальных мембран. Полосы также совпадали с областями высокой плотности актина (LifeAct-EGFP) и создавали впечатление, что они происходят в основном из одной клетки. Ниже мы увидим, что эта асимметрия полос наиболее вероятна из-за несовпадения ориентации фокальной плоскости и извитых межклеточных контактов. Эта картина была очевидна на ранних этапах формирования просвета и продолжалась по мере удлинения просвета, сохраняя характерный интервал между полосами (рис. 1D, S1).Интересно, что когда просвет выпирал наружу, например, на Рисунке 1D ’(отмечен звездой), стремясь к сферическому просвету, это совпало с потерей полос. Впоследствии трубчатая форма просвета восстановилась после образования дополнительных полос, что указывает на активную связь между полосатым рисунком и анизотропией удлинения просвета.
Чтобы определить микроструктуру богатых актином полосок, мы проанализировали кортикальный F-актин, меченный Phalloidin-Alexa-647, с помощью микроскопии локализации одной молекулы (SMLM) на фиксированных, in vitro, дифференцированных гепатоцитах.Поразительно, что мы наблюдали квази -периодический паттерн структур F-actin, очевидно пересекающих просвет между двумя клетками (Figure 1E). Поскольку SMLM имеет z-разрешение ~ 500 нм и эти структуры имеют высоту> 1 мкм, мы можем сделать вывод, что F-актин проецируется в просвет BC и не соответствует кольцам вокруг него, как в трахеальной трубке Drosophila. (Hannezo et al., 2015; Hayashi, Dong, 2017).
Ультраструктурный анализ выявляет переборку поперечных структур в просвете BC, физически соединяющих апикальные поверхности соседних клеток
Учитывая наличие как актиновых филаментов, так и плотных контактов (ZO-1), пересекающих просвет, мы исследовали структура апикальных поверхностей соседних клеток более подробно с помощью электронной микроскопии (ЭМ) на серийных срезах и трехмерных реконструкциях всего объема просвета.Примечательно, что ЭМ-сечение на рис. 2А показывает разветвленный просвет между тремя гепатоцитами с характерными гранулами гликогена, поверхности которых соединены пальцеобразными мембранными отростками. Пальцы одной клетки касаются или инвагинируют в противоположную клетку (рис. 2В), а контактные поверхности герметизируются плотными соединениями (рис. 2С, D). Интересно, что мы наблюдали, что везикулы часто накапливались в основе этих отростков.
Рис. 2: Ультраструктурный анализ показывает вид переборок поперечных структур, запечатанных Т-образными плотными соединениями в просвете BC
A) Изображение BC, разветвленного между тремя клетками, с помощью электронной микроскопии.Продольный срез in vitro дифференцированных гепатоцитов. GG: гранулы гликогена. Обведенная область показана на панели B. Масштабная шкала: 5 мкм.
B) Сечение BC, образованное двумя ячейками из серии продольных сечений 90 нм, показанных на Bi-Biv. Выделенные области с поперечными мембранными соединениями показаны на панели C и D . Мембранные соединения видны не на каждой секции (Bi-Biv) . Шкала шкалы: 1 мкм.
C) и D) Детальный вид выделенных областей на панели B . Мембранные соединения образованы апикальными поверхностями обеих ячеек, выстилающих BC, и включают плотные соединения (TJ, стрелки). Везикулы (V) часто накапливаются в непосредственной близости от соединений. Шкала шкалы: 1 мкм.
E) Трехмерная реконструкция серийных срезов в B (Bi-Biv) на основе апикальных плазматических мембран и визуализации плотных контактов. Цитоплазма просветообразующих клеток — зеленого и синего цвета, плотные контакты — красным.См. Также Прил. Видео S1.
F) Упрощенная модель ВС, основанная на трехмерной реконструкции в E с периодическими переборками мембранных соединений, образованных сверху или снизу просвета (стрелки). Плотные соединения (красные) имеют Т-образную форму, причем соединения расположены продольно вдоль трубы, соединенные с соединениями, проходящими вдоль линии гребня внутри каждой переборки. Непрерывный поток в просвете между переборками показан пунктирной линией. См. Также видео на рис. 2F.
По одному сечению невозможно установить, является ли просвет непрерывным или разделен на отдельные камеры. Трехмерная реконструкция (Рисунок 2E, Видео Рисунок 2F, Дополнение Видео S1) показала, что поперечные пальцевидные отростки (Рисунок 2A) были сечениями структур, напоминающих переборки лодки. Переборки состояли из двух частей, каждая из которых образовывалась апикальной поверхностью одной из двух соседних ячеек, которые образовывали гребневидный отросток (см. 3D-модель, рис. 2F, видео, рис. 2F, доп.Видео S1). Важно отметить, что два выступа были герметизированы плотными соединениями, имевшими необычную Т-образную форму, причем горизонтальная полоса представляла соединения, продольные вдоль трубы, а вертикальная полоса — соединения, проходящие вдоль линии гребня (см. Схему на Рисунке 2E, Видео Рисунок 2F, Дополнение видео S1). Данные ЭМ согласуются с наличием структур ZO-1 в полосах, пересекающих просвет (рис. 1B). В некоторых случаях противоположные отростки не выровнены точно по линии гребня, а смещены, образуя широкий плотный контактный пояс (рис. 2B, 2E, переборки B1, 4).Переборки могут выходить либо снизу (рис. 2F, переборка B3), либо сверху (рис. 2B, 2E, переборки B1, 2, 4), но никогда не пересекают ее полностью, что обеспечивает непрерывность просвета в BC (видео Рисунок 2F, Дополнительное видео S1). Следовательно, из трехмерной реконструкции на Рисунке 2B и Приложении. Видео S1 видно, что просвет имеет извилистую форму. Этим объясняется впечатление, что флуоресцентные и светлопольные полосы F-актина лишь частично пересекают просвет (Рис. 1D).Таким образом, квази -периодичность переборок может объяснить паттерн актина, наблюдаемый при визуализации живых клеток (Рис. 1D) и SMLM (Рис. 1E).
В целом, ЭМ-анализ показал, что соседние гепатоциты физически связаны не только вдоль пояса плотных стыков, но и внутри просвета через повторяющиеся поперечные связи между апикальными поверхностями, запечатанными плотными стыками. Эти апикальные структуры, следовательно, могут объяснить высокую плотность F-актина, визуализированную с помощью световой микроскопии (Рис. 1C-E).
Поперечные апикальные мембранные структуры образуются во время морфогенеза просвета BC в эмбриональной печени
Повторяющийся узор переборок поперечных соединений может быть характерной чертой системы культивирования in vitro , где клетки прикрепляются к одной и той же поверхности и вынуждены для формирования 2D-слоев. Чтобы убедиться, что такая организация имеет физиологическое значение, мы исследовали ультраструктуру зарождающегося BC в эмбриональной печени. Также здесь ЭМ на серийных срезах (рис. 3A, B) и трехмерная реконструкция просвета BC (рис. 3C, D) в эмбриональном состоянии (E15.5) печень подтвердила наличие переборки поперечных соединений. Форма просвета была даже более сложной, чем у in vitro , из-за трехмерной организации ткани с более высокой степенью свободы для межклеточных контактов. Важно отметить, что также in vivo переборки не разделяли просвет BC на изолированные камеры (рис. 3C, D). Эти результаты подтверждают структурную организацию гепатоцитов, наблюдаемых in vitro , и подтверждают вывод о том, что две противоположные апикальные поверхности физически связаны поперечными связями.
Рисунок 3: Формирование поперечных апикальных мембранных структур во время морфогенеза просвета BC в эмбриональной печени
A) и B) Изображения электронной микроскопии двух последовательных срезов формирующегося BC в печени E15.5, окруженных плотными соединениями (белые стрелки). Просвет двух соседних гепатоцитов обведен белым. Черные стрелки указывают на плотные стыки внутри мембранных перемычек B1 и B2. Масштабная шкала: 500 нм.
C) и D) 3D модель просвета A.и B., основанный на визуализации поверхности просвета на серийных срезах. В левой нижней части (пунктирная черная линия) продолжается ВС. Белыми стрелками обозначены переборки B1, B2, показанные на A. и B. соответственно. Масштабная шкала: 500 нм.
Преобразование полярности гепатоцитов в простую апико-базальную полярность
Формирование апикальных отростков, подобных перемычке in vitro и in vivo , может быть специфической особенностью канальцевого просвета гепатоцитов, поскольку они никогда не описывались простыми словами. эпителий, включая цисты in vitro .В развивающейся печени гепатобласты могут давать начало гепатоцитам, генерирующим РМЖ, или клеткам желчных протоков, формирующим канальцевый эпителий. При культивировании in vitro клетки желчных протоков образуют трехмерные кисты со сферическим просветом (Huch et al., 2013; Prior et al., 2019; Tanimizu et al., 2007). Наша цель состояла в том, чтобы использовать первичные гепатобласты для преобразования одного типа клеточной полярности в другой. С этой целью мы создали систему in vitro , которая может воспроизводить как гепатоциты, так и простую апико-базальную полярность одновременно, бок о бок в одной и той же культуре.Чтобы нейтрализовать эффект ЕСМ (Tanimizu et al., 2004, 2007) и сосредоточить внимание на внутренних клеточных факторах, регулирующих форму просвета, мы использовали первичные гепатобласты в тех же условиях культивирования. Путем оптимизации условий культивирования (см. Методы) гепатобласты, которые дифференцировались в гепатоциты, образовали разветвленные BC-подобные структуры на дне лунки (рис. 4A), тогда как клетки желчных протоков (Sox9-положительные) образовали трехмерные кисты, которые поднимались из дно в среду (рис. 4A ‘, A’ ‘).
Рисунок 4: Преобразование полярности гепатоцитов в простую апико-базальную полярность (см. Также рисунок S4)
A) Проверка системы культивирования.Смесь первичных гепатобластов и клеток желчных протоков образует BC и цисты в одних и тех же условиях культивирования. Изображения в различных z-положениях демонстрируют, что цисты растут в z-направлении (A ’, A’ ’), в то время как гепатоциты с BC образуют клеточный слой вблизи дна лунки. Клетки окрашивали на F-актин с помощью Phalloidin-Alexa488. Шкала шкалы: 10 мкм. Схемы представляют вид XZ.
B) Нокдаун Rab35 в дифференцирующихся гепатобластах вызывал образование цистоподобных структур (B ’), тогда как клетки, обработанные контрольной siRNA (siLuc), не были затронуты и образовали BC.Микроскопические изображения клеток, окрашенных на F-актин с помощью Phalloidin-Alexa488. Шкала шкалы: 30 мкм. См. Также видео рисунок 4B ’(шкала: 30 мкм).
C) 3D-реконструкция клеток, обработанных миРНК Rab35, демонстрирует вариабельность фенотипа от увеличенного набухшего просвета до сферических кистоподобных структур, растущих в z-направлении (просвет окрашен апикальным маркером CD13). БК, соединенный с кистой, напоминает организацию перипортальной зоны в ткани печени.
D) Три независимых дуплекса миРНК Rab35 подавляют уровни белка Rab35 на 73% ± 3% (n = 3, планка погрешностей: стандартное отклонение).Репрезентативный вестерн-блоттинг и количественная оценка нокдауна белка.
E) Микроскопические изображения дифференцированных гепатоцитов, обработанных люциферазой или миРНК Rab35, окрашенных антителами Rab35 (желтый). Rab35 локализуется в апикальной и латеральной плазматической мембране и цитоплазматической точке. Уровни Rab35 заметно снижаются в кистоподобных структурах, образованных после трансфекции siРНК Rab35.
F) Локализация экзогенного EGFP-Rab35 в поляризующих гепатобластах.Шкала шкалы: 10 мкм.
G) Гистограмма локального радиуса просвета в контрольных клетках и клетках, обработанных миРНК Rab35, оцененная на основании анализа изображений под микроскопом. Нокдаун Rab35 тремя независимыми миРНК приводит к смещению в сторону просвета с большим радиусом (n = 3 (с 4 изображениями на условие), планки ошибок: SEM).
H) Фенотип увеличенного просвета в клетках, обработанных миРНК Rab35, восстанавливается за счет экспрессии человеческого Rab35-EGFP из рекомбинантного аденовируса.Частотная кривая радиуса просвета (желтый) перекрывается с одной из контрольных клеток, экспрессирующих только EGFP. Сам по себе EGFP не влияет на увеличение просвета, вызванное нокдауном Rab35 (красный). (n = 3 (с 4 изображениями на условие), планки ошибок: SEM).
Достигнув системы in vitro , которая воспроизводит два типа клеточной полярности и морфологии просвета, мы приступили к идентификации генов, необходимых для этих процессов, с использованием подхода РНКи. На сегодняшний день только несколько генов связаны с регуляцией морфологии просвета гепатоцитов ( Mark2 / Par1b, Pard3, Stk11 / Lkb1, Cdc42 ) в клеточных линиях гепатоцитов или первичных гепатоцитах (Cohen et al., 2004b; Fu et al., 2010; Wang et al., 2014; Юань и др., 2009). Мы провели целенаправленный скрининг 25 генов-кандидатов, включая вышеупомянутые, кодирующие ключевые регуляторные компоненты полярности клеток (Таблица S1): формирование апикального соединения (например, Pard3, Tjp1, Cldn2), регуляция цитоскелета (например, Mark2 / Par1b, Stk11 / Lkb1). , Cdc42) и поляризованный трафик (например, Rab11a, Rab35, Cdc42). Для скрининга мы разработали независимые дуплексы миРНК с использованием специализированного программного обеспечения, отобрали шесть миРНК с наивысшей оценкой функциональности на каждый ген-мишень и синтезировали их с модификациями для повышения их стабильности (Farzan et al., 2017; Reynolds et al., 2004). Клетки трансфицировали миРНК и через 5 дней в культуре окрашивали на F-актин, который обогащен в апикальном домене (рис. 1C, D, 4A). Хит-кандидатами были те, которые давали фенотип проникающего просвета как минимум с двумя миРНК. Подавление Ocln (рисунок S4A) и Tjp1 (рисунок S4B) привело к потере полярности с де-локализацией F-актина и уменьшением интенсивности апикального маркера CD13 из-за отсутствия просвета. Примечательно, что из 25 проверенных генов молчание Cdc42 и Rab35 не повлияло на полярность клеток, судя по локализации CD13 и ZO-1, но изменило морфологию просвета (рис. S4C, 4B, S4D).Молчание Cdc42 вызывает расширение сферического просвета (Figure S4D, Table S1), таким образом воспроизводя фенотип, описанный у печеночно-специфичных мышей Cdc42 KO (Yuan et al., 2009), и подтверждая наш подход. Однако нокдаун Rab35 дал наиболее яркий фенотип, что привело к образованию крупных кистоподобных структур (фиг. 4B, S4D и видео-фиг. 4B ’) вместо BC, как в контроле (Люцифераза, siLuc). Оптическое сечение и трехмерная реконструкция показали, что просвет этих кист был связан с БК, образованным соседними гепатоцитами (рис. 4С), что указывает на то, что клетки действительно отображали два типа полярности бок о бок, напоминая организацию перистальтики. портальная зона ткани печени (Antoniou et al., 2009; Мюш, 2018; Обер и Лемегр, 2018). Rab35 — это универсальная малая ГТФаза, участвующая во многих клеточных процессах, связанных с полярностью клеток и образованием просвета (Klinkert and Echard, 2016). Учитывая силу фенотипа и поскольку Rab35 ранее не имел связи с морфологией просвета гепатоцитов, мы решили сосредоточиться на этом гене и изучить его функцию более подробно.
Rab35 лимитирует скорость образования просвета гепатоцитов
Для начала мы подтвердили специфичность фенотипа Rab35 РНКи.Во-первых, из шести разработанных миРНК пять давали подавление мРНК Rab35 более чем на 50% через 96 часов и демонстрировали различную степень изменения просвета. Три миРНК (siRab35 # 2, # 4, # 5), которые последовательно давали наиболее сильный фенотип, снижали мРНК Rab35 (Рисунок S4F) и уровень белка более чем на 70% (Рисунок 4D). Во-вторых, Rab35 был обогащен апикальной поверхностью гепатоцитов, а также латеральной плазматической мембраной и цитоплазматическими пузырьками (рис. 4E), что согласуется с описанной эндосомной локализацией (Klinkert et al., 2016; Куранти и др., 2006). После замалчивания это окрашивание заметно уменьшилось (рис. 4E). В-третьих, экспрессия экзогенного EGFP-меченного Rab35 дала аналогичный образец локализации (рис. 4F). Интересно, что Rab35 не только обогащен апикально, но также присутствует на поперечных связях, которые динамически ремоделируются, поскольку апикальный просвет анизотропно расширяется (Рис. 4F). В-четвертых, чтобы дополнительно подтвердить, что потеря Rab35 является специфической причиной наблюдаемого фенотипа, мы провели эксперимент по спасению, в котором мы восстановили экспрессию Rab35 посредством вирусной трансдукции человеческого Rab35, устойчивого к siRab35 # 4.Мы количественно оценили эффект нокдауна Rab35 на морфологию просвета, измерив радиус отдельного просвета в контрольных и нокдаунных условиях и построив график частотного распределения значений. Три дуплекса миРНК, нацеленные на мРНК Rab35, наблюдали постоянный сдвиг в сторону большего просвета в условиях нокдауна (рис. 4G). Важно, что в контрольных условиях мы едва могли наблюдать просвет с радиусом более 6 мкм, тогда как после подавления Rab35 ~ 20-25% просвета имели радиус> 6 мкм.Опосредованная аденовирусом экспрессия EGFP-меченного Rab35 была способна спасти фенотип подавления Rab35, сдвигая распределение радиуса просвета в сторону контроля, тогда как экспрессия EGFP не влияла (фиг. 4H). В целом, эти результаты предполагают, что Rab35 лимитирует скорость генерации просвета гепатоцитов BC и его истощение вызывает образование кистоподобных структур, подобных тем, которые формируются клетками желчных протоков in vitro .
Молчание Rab35 вызывает потерю поперечных апикальных переборок и образование сферических кист за счет процесса самоорганизации клеток
Чтобы понять механизм истощения Rab35 при морфогенезе просвета, мы визуализировали экспрессирующие LifeAct-EGFP клетки, трансфицированные Rab35 или Люцифераза siRNA в качестве контроля с помощью покадровой микроскопии живых клеток, как описано выше (Рисунок 1D, Рисунок S1).В то время как нормальные и контрольные дифференцирующиеся гепатобласты, трансфицированные siRNA люциферазы, образовывали удлиненный просвет, после трансфекции siRNA Rab35 они генерировали сферический просвет, первоначально между двумя клетками (фиг. 5A, видео-фиг. 5A). Со временем мы могли наблюдать основные перестройки клеток, в результате которых клетки перемещались и меняли форму своей апикальной поверхности, что приводило к слиянию просвета и формированию трехмерных многоклеточных кист (Рисунок 5B, видео Рисунок 5B), как показано на рисунке 4C. Также в этом случае такая реорганизация не была результатом деления клеток, как для других цист, образованных in vitro (Jewett and Prekeris, 2018), а скорее в результате процесса самоорганизации.Сферическое расширение просвета происходило только в тех случаях, когда клетки не могли сформировать полосатый актиновый паттерн, указывающий на переборки, обычно присутствующие в просвете BC (фиг. 5A, B, видео, фиг. 5A, 5B). Напротив, удлиненный просвет, который все еще сформировался, всегда содержал поперечные полосы актина. Тщательный осмотр видео изображений живых клеток (например, видео на рис. 1D, 5B) показал, что исчезновение поперечных переборок предшествует формированию сферического просвета.
Рисунок 5: Молчание Rab35 вызывает потерю поперечных переборок апикальной мембраны и образование сферических кист в результате процесса самоорганизации клеток
A) В клетках, обработанных миРНК Rab35, просвет имеет тенденцию расти в виде сфер, а не удлиненные, как трубочки.Изображения из эксперимента с покадровой микроскопией живых клеток, показывающие два соседних дифференцирующихся гепатобласта, экспрессирующих LifeAct-EGFP в условиях siRNA Rab35. Белая звезда указывает на формирующийся просвет между двумя ячейками. Обратите внимание, что типичный поперечный полосатый паттерн актина, наблюдаемый в трубчатом BC, отсутствует. Шкала шкалы: 10 мкм. См. Также видео рисунок 5A (шкала: 10 мкм).
B) Многоклеточные кистоподобные структуры образуются в результате перегруппировки клеток. Изображения из эксперимента по покадровой микроскопии живых клеток.Клетки самоорганизуются таким образом, что три отдельных просвета (черная звезда) в конечном итоге сливаются в один большой сферический просвет при отсутствии деления клеток. Шкала шкалы: 10 мкм. См. Также видео рисунок 5B (шкала: 10 мкм).
C) EM анализ кистообразного просвета, возникшего в результате нокдауна Rab35. Между пятью клетками образованы три последовательных продольных участка просвета по 90 нм. В просвете отсутствуют переборки, характерные для БК гепатоцитов. Стрелки указывают на плотные стыки.GG: гранулы гликогена. Шкала шкалы: 5 мкм.
D) Продольный вид через середину 3D-модели просвета на основе визуализации плазматических мембран и плотных контактов (красный) на серийных срезах. Пять клеток, образующих просвет, представлены разными цветами (голубым, фиолетовым, желтым, синим и зеленым). Красные стрелки указывают на плотные соединения, в которых киста разрезана, чтобы показать сагиттальный вид на (D).
E) Сагиттальный вид просвета. Просвет имеет круглый профиль, и плотные соединения не выступают в просвет.
Чтобы подтвердить потерю переборок в сферическом просвете, мы исследовали их ультраструктуру с помощью ЭМ на серийных срезах и трехмерной реконструкции всего объема просвета. Мы сосредоточились на большом кистообразном просвете, образованном несколькими клетками. Отдельные ЭМ-срезы кистообразного просвета между пятью клетками показали, что переборки, которые обычно присутствуют в просвете BC, отсутствуют (рис. 5C). Это было подтверждено трехмерной моделью просвета, основанной на визуализации плазматических мембран и плотных контактов (рис. 5D).Кроме того, плотные соединения между клетками не выступали в просвет, как видно на сагиттальном поперечном сечении 3D-модели (рис. 5D).
Эти результаты подтверждают, что подавление Rab35 в дифференцировке гепатобластов вызывает потерю поперечных переборок и превращает просвет канальцев BC в кистоподобные структуры.
Подавление Rab35 влияет на дифференцировку гепатоцитов
Кистоподобные структуры, генерируемые на Rab35 KD дифференцировкой гепатобластов, напоминают кисты, образованные Sox9-положительными первичными клетками желчных протоков in vitro (Рисунок 4A).Это поднимает вопрос о том, вызывает ли потеря Rab35, помимо модификации фенотипа клеточной полярности, изменение приверженности гепатобластов клеткам желчных протоков или, альтернативно, изменение судьбы клеток гепатоцитов. Чтобы ответить на этот вопрос, мы охарактеризовали профиль транскрипции клеток при молчании Rab35 с помощью анализа RNA-seq. Мы обнаружили 313 дифференциально транскрибируемых генов в клетках, трансфицированных миРНК Rab35 по сравнению с миРНК Luc в качестве контроля (логарифм 2, отсечка изменения в раз 0.5, пороговое значение p 0,01). Поразительно, что гены-маркеры зрелых гепатоцитов, например Serpina1, Ces1c, Pck1, Cyp3a11 подавлялись в клетках, трансфицированных siRab35 (фиг. 6A, отрицательное изменение Log , 2 -кратное изменение, пурпурный), тогда как гены, связанные с апико-базальной полярностью в эпителиальных клетках, обычно не экспрессируются. в гепатоцитах, были активированы (Фигура 6A, положительное Log 2 -кратное изменение, зеленый), например Ap1m2, Mal, Grhl2 и Rab25 (Fölsch et al., 1999; Ramnarayanan et al., 2007; Senga et al., 2012). Grhl2 был идентифицирован Senga et al. (2012) как фактор транскрипции, специфичный для клеток желчных протоков, утверждая, что клетки приобретают черты клеток желчных протоков. Этот вывод был подтвержден открытием, что маркеры клеток желчных протоков Tacstd2 ( Trop2 ) и Krt19 (Segal et al., 2019) также были активированы. Мы проверили экспрессию различных маркеров на уровне белка с помощью иммунофлуоресценции, особенно в клетках, образующих цисты в результате молчания Rab35 (рис. 6В).Некоторые клетки цист продолжали экспрессировать альбумин (хотя и на более низком уровне), сохраняли накопление гранул гликогена в цитоплазме и не имели ресничек (рис. 5C), что позволяет предположить, что эти гепатобласты дифференцировались в гепатоциты, а затем изменили судьбу клеток в сторону клетки желчных протоков. Однако другими клетками были Krt19 + / Alb- (обрисованные в общих чертах на Фигуре 6B), что свидетельствует об активации программы клеток желчных протоков в гепатобластах. Тем не менее, эти клетки не экспрессировали Sox9, ранний маркер клеток желчных протоков, необходимых для образования ресничек (Antoniou et al., 2009; Poncy et al., 2015), указывая на то, что они не приобретают полную судьбу клеток желчных протоков.
Фигура 6: Понижающая регуляция Rab35 влияет на дифференцировку гепатоцитов
A) График вулкана, показывающий повышенную и понижающую регуляцию генов при обработке siRNA Rab35 по сравнению с контрольной siRNA. Гены-маркеры для гепатоцитов подавляются (пурпурный, например, Serpina1e, Ces1c, Pck1, Cyp3a11 ), тогда как гены, как правило, экспрессируются не в гепатоцитах, но в других типах эпителиальных клеток регулируются (зеленый, e.грамм. А p1m2, Grhl2, Rab25, Krt19 ).
B) Иммунофлуоресцентные микроскопические изображения кистоподобной структуры по сравнению с контрольными клетками. В кисте некоторые клетки положительны по Krt19 (белый контур) и почти не имеют экспрессии альбумина. В контроле практически не обнаруживается Krt19. Шкала шкалы: 10 мкм.
C) Графики обогащения из анализа обогащения набора генов (GSEA) для проверки того, обогащены ли дифференциально экспрессируемые гены в A профилями экспрессии генов гепатоцитов, гепатобластов или клеток желчных протоков.Гены с пониженной регуляцией (пурпурный) избыточно представлены в гепатоцитах, тогда как гены с повышенной регуляцией (зеленый цвет) обогащены профилем экспрессии генов клеток желчных протоков. P-значения указаны над кривой GSEA.
Рисунок 7: Выключение Rab35 in vivo приводит к изменению полярности клеток и архитектуры ткани печени (см. Также рисунок S7)
A) Иммунофлуоресцентные изображения ткани печени, полученные через 4 дня после in utero инъекции люциферазы (siLuc) и миРНК Rab35 (siRab35), сформированные в LNP через желточную вену в E13.5 эмбрионов. Квадрат на изображениях с низким увеличением (масштабная полоса: 500 мкм) показывает, где было снято изображение с высоким разрешением (масштабная полоса: 20 мкм). Изображаемые области расположены в паренхиме печени, лишенной маркера клеток желчных протоков Sox9. Вставки (масштабная линейка: 20 мкм) на панелях A ’ и A’ ’ показывают разницу между BC и просветом желчного протока в печени, инъецированной LNP-siRab35. Панель A ’’ ’ сравнивает просвет канальцев в паренхиме с просветом желчного протока в портальной области (Sox9-позитивный).
B) Иммунофлуоресцентные изображения тканей печени из A показывают примеры полярности гепатоцитов в контрольной ткани (один гепатоцит образует несколько просветов на клетку) и простой апико-базальной полярности в печени, инъецированной LNP-siRab35 (клетки имеют единый апикальный домен, ориентированный на общий просвет).
C) и D) 3D реконструкция просвета, меченного апикальным маркером CD13, в срезах ткани печени толщиной 100 мкм, инъецированных LNP-siLuc ( C ) и LNP-siRab35 ( D ).Шкала шкалы: 30 мкм. См. Также видео рисунок 7CD.
E) Количественная оценка распределения радиуса просвета на основе трехмерных реконструкций, таких как C и D (n = 3, планки ошибок: SEM).
F) Трехмерная реконструкция канальца, обнаруженного в печени, инъецированной LNP-siRab35, показывает просвет зеленого цвета, окруженный множеством клеток. См. Также Видео Рисунок 7F.
G) Количественная оценка количества клеток, окружающих просвет, по отношению к радиусу просвета и положению вдоль канальца.
Чтобы понять, в какой степени молчание Rab35 изменяет дифференцировку клеток-предшественников гепатоцитов, мы сравнили транскриптом клеток, трансфицированных siRNA (контроль и siRNA Rab35, фиг. 6A), с транскриптомом трех типов клеток: гепатобластов, взрослых гепатоцитов и клеток желчных протоков. . С этой целью мы выполнили анализ обогащения набора генов (GSEA), широко используемый метод интерпретации данных экспрессии генов (Mootha et al., 2003; Subramanian et al., 2005). GSEA рассчитывает так называемую оценку обогащения, которая показывает, насколько сильно данный набор генов чрезмерно представлен среди генов с высоким рейтингом в списке.При построении оценки обогащения восходящая кривая в левой части графика указывает на чрезмерную представленность в верхней части ранжированного списка генов. В нашем анализе все три ранжированных списка были созданы с использованием DESeq2 (Love et al., 2014) и отражают сравнение профилей экспрессии генов между одним типом клеток и двумя другими. На первом этапе мы использовали GSEA для исследования чрезмерной представленности генов, подавляемых при подавлении Rab35 молчания в трех вышеупомянутых типах клеток. Полученные графики обогащения (верхний ряд на фиг. 6C) ясно показывают чрезмерную представленность исследуемого набора генов во взрослых гепатоцитах.В гепатобластах было обнаружено лишь небольшое избыточное количество, тогда как в клетках желчных протоков не наблюдалось никакого обогащения. Затем мы повторили анализ, используя набор генов, активируемых при замалчивании Rab35. Интересно, что полученные графики (нижний ряд рисунка 6C) показали чрезмерное представительство исследуемого набора генов в клетках желчных протоков, в то время как едва ли можно было обнаружить какое-либо обогащение или его отсутствие в двух других типах клеток. Это подтверждает положительную корреляцию профилей экспрессии генов между транскриптомами трансфицированных siRab35 и клеток желчных протоков.
Таким образом, результаты показывают, что подавление Rab35 изменяет профиль транскрипции гепатобластов, предполагая как изменение предопределенности клеток гепатоцитов по умолчанию ( in vitro, ) в отношении судьбы клеток желчных протоков, так и изменение судьбы клеток. через переход от дифференцированных гепатоцитов к клеткам желчных протоков. Такой переход не является однозначным, так как в некоторых клетках он более эффективен, чем в других, и ни одна из них не приобретает полную судьбу клетки желчного протока.
Реинжиниринг архитектуры ткани печени путем подавления Rab35
in vivo
Специфическая полярность гепатоцитов является ключевым элементом для организации ткани печени, в частности формирования сети BC, которая очень отличается от других простых эпителий , включая желчный проток. Изменение полярности клеток, вызванное замалчиванием Rab35 в дифференцирующихся гепатобластах in vitro , предоставляет средства для попытки реконструировать ткань печени путем модификации просвета BC и самоорганизации клеток in vivo .Таким образом, мы настроили изменить полярность гепатоцитов путем подавления Rab35 в развивающейся печени in vivo . Полная потеря Rab35 в линии мышей KO является эмбрионально летальной (Dickinson et al., 2016), предположительно из-за дефектов цитокинеза (Kouranti et al., 2006). Чтобы обойти эту проблему и истощить Rab35 как in vitro , мы воспользовались липидными наночастицами (LNP), разработанными для терапевтических средств человека, что обеспечивает специфическую доставку миРНК к гепатоцитам в печени (Akinc et al., 2010; Zeigerer et al., 2012). Для нацеливания на эмбриональную печень E13.5 мы использовали метод инъекции in utero через желточную вену (Ahn et al., 2018). Сначала мы проверили методику на мышах, экспрессирующих GFP, нацеленную на мембрану. Мы выполнили инъекцию in utero миРНК LNP-GFP или люциферазы (в качестве контроля) в эмбрионы E13.5 и собрали печень через 4 дня развития (рисунок S7A). Сигнал GFP в печени был заметно и однородно снижен в гепатоцитах, тогда как разные типы клеток, например.грамм. гемопоэтические клетки не были затронуты (фигура S7B).
Затем мы сформулировали миРНК Rab35, подтвержденную in vitro (фиг. 4D, G, H), и миРНК люциферазы в LNP и вводили их в эмбриональную печень, как описано выше. Мы проанализировали влияние на ткань печени, используя последовательность иммуноокрашивания, визуализации глубоких тканей и трехмерной реконструкции (Morales-Navarrete et al., 2015) (рис. 7A). Как и в контрольной печени, в печени E17.5, инъецированной миРНК LNP-люциферазы, развивались нормальные удлиненные канальцы BC, образованные двумя соседними гепатоцитами (фигура 7A ’).Поразительно, что инъекция миРНК LNP-Rab35 индуцировала образование крупных трубчатых структур в паренхиме печени (фигура 7A ’’). Поскольку эти структуры очень похожи на желчные протоки на этой стадии развития, нам нужно было исключить, что они могут быть образованы клетками желчных протоков. Во-первых, трубчатые структуры присутствуют по всей паренхиме и удалены от портальной области, где расположены желчные протоки. Во-вторых, окрашивание HNF4a и Sox9 подтвердило, что клетки, образующие канальцы, экспрессировали маркеры гепатоцитов и не были полностью дифференцированными клетками желчных протоков (рис. 7A ’’ ’Suppl.Рисунок S7C), аналогичный клеткам in vitro (Фигура 5C, 6B). Важно отметить, что организация канальцев предполагает изменение полярности клеток. В то время как в контрольной ткани отдельные гепатоциты образовывали множественные просветы на клетку (характеристика полярности гепатоцитов), клетки, образующие большие трубчатые структуры, поляризованные с одной апико-базальной осью и имели общий апикальный просвет (Рисунок 7B, см. Ниже).
Чтобы продемонстрировать, что большие трубчатые структуры не изолированы, а являются частью взаимосвязанной просветной сети, мы выполнили трехмерную реконструкцию апикальных поверхностей (отмеченных CD13) на срезах толщиной 100 мкм (Рисунок 7B).В нормальной печени и печени, в которую была введена миРНК LNP-люциферазы, CD13 имел типичный вид трехмерной сети BC (фиг. 7C, видео-фиг. 7CD). Напротив, в печени, инъецированной siRNA Rab35, 3D-реконструкция выявила глубокие изменения морфологии просвета вблизи центральной вены, то есть на расстоянии от перипортального желчного протока (рис. 7D, видео-рис. 7CD). Количественная оценка реконструированного просвета показала общее увеличение радиуса просвета (рис. 7E), подобное тому, которое наблюдалось in vitro (рис. 4G).Примечательно, что 30 ± 11% просвета имели радиус просвета значительно больше, чем BC в контрольной печени. Трехмерная реконструкция сегментов больших трубчатых структур подтвердила, что трубки образованы множеством клеток, в среднем 4 клетки имеют один и тот же просвет (Рисунок 7F, G; Видео Рисунок 7F). Эти результаты предполагают, что нам удалось реорганизовать структуру ткани печени путем подавления Rab35 in vivo . Это привело к модификации клеточной полярности гепатоцитов, которые вместо образования BC самоорганизовались в канальцевые эпителиальные структуры, подобные желчным протокам.
Обсуждение
Механизмы, лежащие в основе специфической полярности гепатоцитов и образования РМЖ, плохо изучены, и были предложены различные модели, включая асимметричное деление клеток (Fu et al., 2011; Li et al., 2016; Müsch, 2018; Обер, Лемегре, 2018; Танимидзу, Митака, 2017). Однако в эмбриональной печени создается почти полностью связанная сеть BC, несмотря на постепенное прекращение пролиферации гепатобластов (Tanimizu et al., 2016; Yang et al., 2017, рисунок 7C).Более того, первичные зрелые гепатоциты в культуре могут образовывать канальцевую сеть BC без значительного клеточного деления (Fu et al., 2010). В этом исследовании мы искали механизм, который мог бы объяснить своеобразную трубчатую форму апикального просвета гепатоцитов. Мы обнаружили наличие очень специфических расширений апикальной мембраны, запечатанных плотными контактами в просвете между двумя соседними гепатоцитами, которые удовлетворяют критериям, позволяющим анизотропное удлинение формирующегося канальца BC. Лучшая аналогия, которую мы могли найти этим конструкциям, — это переборки лодок, кораблей и самолетов.Переборки обеспечивают конструктивную устойчивость и жесткость, укрепляя структуру сосудов удлиненной формы. Здесь апикальные переборки являются квази--периодическими и могут обеспечивать механическое соединение между апикальными поверхностями гепатоцитов, которые остаются «слипшимися» вместе по мере роста просвета. В их отсутствие (при подавлении Rab35) апикальные поверхности гепатоцитов теряют свой анизотропный рост, и просвет превращается из удлиненного в сферический, что типично для простых эпителиальных клеток. Таким образом, наши данные предполагают, что механическое соединение между гепатоцитами лежит в основе образования РМЖ и дает беспрецедентное понимание давней проблемы эпителиального морфогенеза паренхимы печени.
В нашей установке культуры первичные гепатобласты дифференцируются в гепатоциты и повторяют образование BC без деления клеток, что подтверждается экспериментами по визуализации живых клеток. Первоначально гепатоциты образуют просвет между дублетами клеток. Просветы закрыты и не имеют выхода для слива внутренней жидкости. Следовательно, увеличение осмотического давления в результате прокачки осмолитов через апикальную мембрану должно приводить к образованию сферического просвета, а не трубчатого. Из физики тонких оболочек образование трубчатого просвета с внутренним давлением и без выходов требует анизотропии поверхностного натяжения и / или жесткости стенки (Berthoumieux et al., 2014; Ландау, Лифшиц, 1986). Перегородки являются конструктивными элементами, которые могут обеспечить такую анизотропию и механическую стабильность удлиненного просвета под внутренним давлением. Положение переборок может быть определено с помощью механо-чувствительных механизмов, связанных с натяжением и локальной кривизной через актиновую кортикальную сетку (Meyer et al., 2020). Переборки были обнаружены в эмбриональной печени, что позволяет предположить, что они не являются артефактом клеточной культуры, но имеют физиологическое значение. Удлинение апикального просвета влечет за собой также перемещение и перегруппировку межклеточных контактов, что сопровождается образованием новых переборок (Рис. 1D, S1C).Соответственно, в отсутствие переборок просветы растут изотропно, образуя цисты вместо рядов гепатоцитов (рис. 5A и 5B).
Обнаружение апикальных переборок гепатоцитов привлекает внимание к механизму, лежащему в основе их образования. Мы получили несколько сигналов из морфологического анализа и функционального скрининга с помощью РНКи. Во-первых, переборки характеризуются Т-образным расположением герметичных соединений, которые герметизируют две половины переборок (рис. 1B, 2F).Насколько нам известно, такая организация беспрецедентна для поляризованных ячеек. Вполне возможно, что Т-образное расположение плотных соединений могло происходить от соединений, продольных вдоль канальца (горизонтальная полоса в Т) и застегивающихся вдоль линии гребня (вертикальная полоса Т), либо снизу, либо со стороны вершина. Во-вторых, учитывая, что плотные контакты связаны с актиновыми филаментами, неудивительно, что переборки содержат F-actin поперек удлинения просвета. Присутствие F-actin в переборках д. Вносить анизотропию в апикальное поверхностное натяжение, приводя к образованию трубчатого, а не сферического просвета.Визуализация живых клеток показала, что структуры F-actin динамичны и адаптируемы и, следовательно, соответствуют требованиям растущей, ветвящейся и сливающейся BC сети in vivo . Сборка переборок потребует, чтобы мембрана была нанесена на апикальную поверхность, что может быть доставлено путем локальной секреции или рециркуляции из эндосомальной системы. В соответствии с таким требованием оборота мы наблюдали накопление пузырьков у основания переборок. В-третьих, с помощью целенаправленного скрининга РНКи установленных регуляторов полярности клеток мы обнаружили, что малая ГТФаза Rab35, регулятор рециклинга эндосом (Klinkert et al., 2016; Куранти и др., 2006; Mrozowska, Fukuda, 2016), необходим для формирования апикальных переборок и формы апикального просвета гепатоцитов.
В эпителиальных клетках Rab35 локализуется на апикальной и латеральной плазматической мембране (Kouranti et al., 2006) и функционально связан с поляризованным транспортом и организацией актина (Klinkert and Echard, 2016). В поляризующих гепатобластах Rab35 также обогащается апикальной плазматической мембраной, где образуются переборки. Однако, в то время как подавление Rab35 в цистах MDCK привело к инверсии полярности (Klinkert et al., 2016), это не вызывало потери или инверсии полярности в гепатобластах, но приводило к исчезновению переборок и переходу от полярности гепатоцитов к простой апико-базальной полярности. Эти результаты предполагают, что Rab35 лимитирует скорость образования переборок в гепатоцитах. Основываясь на предыдущей работе над функцией Rab35 (Klinkert and Echard, 2016; Kouranti et al., 2006), мы предполагаем, что он может регулировать внутриклеточное распределение и функцию апикальных рециклирующих эндосом для доставки трансмембранных белков, например.грамм. компоненты соединения, в месте зарождения и / или роста переборок. Присутствие скоплений пузырьков у основания переборок, как визуализировано с помощью ЭМ, поддерживает эту точку зрения. Однако известно, что Rab35 координирует перенос мембран с организацией актинового цитоскелета (Chua et al., 2010; Klinkert and Echard, 2016). Следовательно, Rab35 может регулировать зарождение и / или динамику F-актина на переборках. Для тестирования этих моделей потребуется ряд подходов, в том числе использование преимуществ предыдущих исследований генов, регулирующих полярность гепатоцитов.Было показано, что Lkb1 является частью молекулярного пути, включающего cAMP-Epac-MEK-AMPK, регулирующий формирование сети BC (Fu et al., 2010, 2011; Homolya et al., 2014; Woods et al., 2011). Сообщалось, что Pard3, Par1b и различные клаудины влияют на полярность гепатоцитов, когда они истощены в различных клеточных линиях гепатоцитов (Can10, HepG2 и WIFB9) и в первичных взрослых гепатоцитах (Grosse et al., 2013; Slim et al., 2013) ; Son et al., 2009; Wang et al., 2014). Таким образом, функция этих генов должна быть пересмотрена в контексте переборок и анизотропии удлинения просвета.Будет важно изучить роль актинового цитоскелета, например, с помощью различных лекарств, при условии, что они не нарушают полярность и не вызывают плейотропные цитотоксические эффекты. Роль Rab35 может быть опосредована его известными эффекторами, регулирующими актиновый цитоскелет (например, MICAL1 и OCRL; Chaineau et al., 2013; Dambournet et al., 2011; Frémont et al., 2017) или неизвестными гепатоцит-специфическими эффекторами. В этом отношении анализ транскриптомики выявил большое количество генов-кандидатов, дифференциально экспрессируемых в гепатоцитах по сравнению склетки желчных протоков и регулируются в большую или меньшую сторону при молчании Rab35. Таким образом, изучение механизмов образования переборок потребует широкомасштабной экспериментальной стратегии.
Примечательно, что подавление Rab35 не только изменило морфологию просвета поляризующих гепатобластов in vitro , но также позволило нам реконструировать организацию развивающейся паренхимы печени, которая показала поразительное увеличение крупных трубчатых структур, напоминающих желчные протоки. Это означает, что нам удалось преобразовать полярность гепатоцитов в простую апико-базальную полярность также in vivo .Неожиданно, истощение Rab35 также изменяет приверженность гепатобластов клеткам желчных протоков и / или переключает гепатоциты на программу клеток желчных протоков, хотя и не полностью. Некоторые клетки сохраняют черты гепатоцитов, тогда как др. Действительно экспрессируют маркеры клеток желчных протоков, но не Sox9, необходимые для образования ресничек. Мы не можем определить, влияет ли подавление Rab35 прямо на судьбу клеток желчных протоков, или это является следствием изменения полярности клеток. Одна из возможностей состоит в том, что морфология просвета определяется поляризующими гепатобластами, например.грамм. через механочувствительный путь, который отвечает за программу транскрипции клетки. Интересно, что в нейроэпителии сетчатки и поджелудочной железы решением судьбы клеток можно было манипулировать, изменяя размер апикального домена, что отражалось на активности сигнального пути Notch (Clark et al., 2012; Löf-Öhlin et al., 2017 ). Помимо Rab35, другие хорошо известные белки клеточной полярности Crb3 и Cdc42 могут прямо или косвенно влиять на судьбу клеток-предшественников (Szymaniak et al., 2015, Кесаван и др., 2009). В то время как Crb3 регулирует клеточную судьбу эпителиальных клеток дыхательных путей путем прямого взаимодействия с компонентами пути Hippo (Szymaniak et al., 2015), Cdc42 играет неавтономную роль клеток в спецификации предшественников поджелудочной железы, контролируя их окружающее микроокружение.
Наши данные представляют собой еще один пример сложного взаимодействия между полярностью клеток, решением судьбы клеток и механизмами самоорганизации ткани, а также дают новое понимание организации ткани печени как в процессе развития, так и у взрослых.Апикальные переборки, по-видимому, являются отличительной чертой гепатоцитов и сети РМЖ. Динамика апикальных переборок и роль актиновых филаментов и ассоциированных факторов будет иметь решающее значение для выяснения взаимодействия между клеточным морфогенезом и механикой клеток и тканей. Кроме того, переборки могут служить горячими точками сократимости для облегчения оттока желчи, как показано in vivo (Meyer et al., 2017; Watanabe et al., 1991). Переборки на судах также могут действовать как (полу) водонепроницаемые отсеки для предотвращения просачивания воды в другие части судна.Точно так же в BC они могут действовать как клапаны, обеспечивающие направленность потока желчи при неперистальтической сократимости. Понимание их структуры и функции, таким образом, предоставит новую информацию о роли актомиозиновой системы в регуляции потока желчи в сети BC.
Вклад авторов
Концептуализация, M.Z., L.B. и Ю.К .; Методология, L.B., J.D. and S.S .; Расследование, L.B., U.R., J.D., S.S., J.I.V., C.F. и H.R .; Программное обеспечение, E.G., H.M-N. и J.I.V; Формальный анализ, L.B., U.R., E.G., H.M-N., J.I.V, C.F. и Ю.К .; Ресурсы, Т.З., Э.С., Т.П., В.К. и M.V .; Визуализация, L.B., U.R., E.G., M.V., J.I.V., H.M-N., C.F. и Ю.К .; Validation, L.B .; Письмо — Эскизный, ЛБ .; Письмо — рецензирование и редактирование, М.З. и Ю.К .; Финансирование, М.З.
Декларация интересов
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.
Дополнительные названия и легенды рисунков
Рисунок S1 (относящийся к рисунку 1): видео-микроскопические изображения живых клеток морфогенеза РМЖ в экспрессирующих LifeAct-EGFP клетках
A) Единственный поляризующий дифференцирующийся гепатобласт, образующий множественные трубчатые просветы.Шкала шкалы: 10 мкм. См. Также видео рисунок S1A.
B) BC Сеть растет между соседними клетками за счет слияния и ветвления (отмечено звездочкой) удлиненного трубчатого просвета. Шкала шкалы: 10 мкм. См. Также видео рисунок S1B.
C) Просвет, образованный между двумя клетками, начинает расти сферически, но позже корректируется и продолжает удлиняться, как типичный просвет BC. Шкала шкалы: 10 мкм. См. Также видео рисунок S1C.
Рисунок S4 (Относится к рисунку 4): Преобразование полярности гепатоцитов в простую апико-базальную полярность
A) Понижающая регуляция окклюдина нарушает формирование просвета в дифференцирующихся и поляризованных гепатобалстах.Иммунофлуоресцентные изображения клеток, окрашенных на апикальный маркер CD13 и окклюдин. Шкала шкалы: 10 мкм.
B) Понижающая регуляция белка плотных контактов ZO-1 нарушает образование просвета у дифференцирующихся и поляризующих гепатобальтов. Иммунофлуоресцентные изображения клеток, окрашенных на ZO-1. Шкала шкалы: 10 мкм.
C) Понижающая регуляция Cdc42 приводит к сферическому просвету вместо BC в поляризующих гепатобластах. Полярность не нарушается, поскольку апикальные маркеры CD13 и ZO-1 все еще локализуются в сформированном просвете.Шкала шкалы: 10 мкм.
D) Подавление Rab35 приводит к глубоким изменениям морфологии просвета поляризующих и дифференцирующихся гепатобластов. Клетки образуют многоклеточные структуры с общим просветом, положительным по апикальным маркерам CD13 и ZO-1. Иммунофлуоресцентные изображения клеток, обработанных тремя различными олигонуклеотидами миРНК. Шкала шкалы: 10 мкм.
E) Оценка эффективности нокдауна шести миРНК, разработанных для нацеливания на мРНК Rab35 через 96 часов после трансфекции в дифференцирующихся и поляризующих гепатобластах in vitro (n = 2, стандартное отклонение).
Рисунок S7 (относящийся к Фигуре 7): In utero метод инъекции, подтвержденный путем подавления GFP в GFP-экспрессирующей линии мышей
A) Схематический обзор экспериментов с инъекциями in utero .
B) Микроскопические изображения, показывающие подавление GFP в печени мышей, экспрессирующих GFP, посредством инъекции in utero LNP-siGFP по сравнению с печенью, инъецированной контрольным LNP-siLuc. Шкала шкалы: 30 мкм.
C) Изображения иммунофлуоресцентной микроскопии печени, инъецированной LNP-siRab35 и окрашенной на HNF4a (желтый) и Sox9 (пурпурный).Шкала шкалы: 30 мкм.
Star Methods
Контактное лицо
Дополнительную информацию и запросы на ресурсы и реактивы следует направлять и выполнять Контактное лицо для ведущих специалистов, Marino Zerial (zerial {at} mpi-cbg.de).
Доступность материалов
Все уникальные / стабильные реагенты, созданные в этом исследовании, доступны у ведущего контактного лица с заполненным соглашением о передаче материалов.
Доступность данных и кода
Данные массового секвенирования РНК будут депонированы в NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) под номером доступа GEO после принятия.Код для скриптов будет доступен после принятия.
Экспериментальная модель и детали объекта
Животные и обращение с животными
Эксперименты на животных проводились в соответствии с немецким законодательством о защите животных в условиях отсутствия патогенов в помещении для животных MPI-CBG, Дрезден, Германия. Мышей содержали в общепринятом помещении с барьерными животными в условиях контролируемого климата в цикле 12 часов света / 12 часов темноты, кормили ad libitum обычным кормом для грызунов.Протоколы были одобрены институциональным инспектором по защите животных (Tierschutzbeauftragter), а необходимые лицензии были получены от региональной комиссии по этике экспериментов на животных Дрездена, Германия (Tierversuchskommission, Landesdirektion Dresden).
Для выделения первичных гепатобластов эмбриональную печень собирали у беременных (E13.5-E14.5) мышей дикого типа C57BL / 6JOlaHsd (Harlan Laboratories / Envigo, США) или C57BL6 / JRj (Janvier Labs, Франция). или трансгенные линии LifeAct-EGFP (Riedl et al., 2010), ROSAmT / mG (Muzumdar et al., 2007) или скрещивание двух трансгенных линий. Для экспериментов с инъекцией in utero LNP GFP-экспрессирующие эмбрионы были получены путем скрещивания ROSAmT / mG самки с самцом PGKCre (J) (Lallemand et al., 1998). Трансгенным эмбрионам или эмбрионам дикого типа инъецировали in utero через желточную вену на E13.5 и собирали печень на E16.5 — E17.5.
Первичные гепатоциты
Первичные гепатоциты выделяли от самцов мышей 8-12 недель в соответствии с установленным протоколом (Klingmüller et al., 2006) и немедленно обработали для выделения РНК.
Клеточная линия Chol / L
Клеточная линия больших холангиоцитов (клеток желчных протоков) (Ueno et al., 2003) культивировалась в виде монослоя или в капле 100% матригеля в среде DMEM + GlutaMAX с высоким содержанием глюкозы (Кат. № 31966, Gibco), 5% FBS (инактивированный нагреванием), 10 мМ HEPES, 1x NEAA (Кат. № 11140-050, Gibco).
QBI-239A
Клеточную линию культивировали в среде DMEM с высоким содержанием глюкозы (каталожный № 41966-029, Gibco) с 5% FBS (инактивированный нагреванием) и использовали для продуцирования аденовируса.
Подробности метода
Выделение Dlk + гепатобластов
Гепатобласты выделяли в виде фракции Dlk + с использованием магнитного разделения клеток. Протокол был адаптирован из Tanimizu et al. (2003) с некоторыми изменениями. Беременных мышей (E13.5-14.5) умерщвляли смещением шейных позвонков. 16-24 эмбриональной печени собирали, фрагментировали и инкубировали в среде для перфузии печени (Thermo Fisher Scientific, каталожный номер 17701-038) в течение 20 минут на водяной бане при 37 ° C. Кусочки печени переваривали в среде Liver Digest Medium (Thermo Fisher Scientific, Cat.№ 17703-034,) с добавлением 10 мкг / мл ДНКазы I (каталожный № DN25, Sigma-Aldrich) в течение следующих 20 мин. Эритроциты лизировали в буфере для лизиса эритроцитов (155 мМ NH 4 Cl, 10 мМ KHCO 3 , 0,1 мМ Na 4 EDTA, pH 7,4). Переваренные клетки инкубировали с блокирующими антителами Крысиные анти-мышиные CD16 / CD32 (BD Biosciences, кат. № 553142, 1: 100) в течение 10 мин, затем с анти-Dlk mAb-FITC (MBL, кат. № D187-4). , 1:40) еще 15 мин. После промывания буфером (0,5% BSA, 2 мМ EDTA в PBS) клетки инкубировали с Anti-FITC MicroBeads (Miltenyi Biotec, Cat.№ 130-048-701, 1:10) в течение 15 мин и разделяют на магнитной колонке (Miltenyi Biotec, № по каталогу 130-024-201) в соответствии с протоколом производителя.
Культивирование и дифференциация гепатобластов
Лунки для культур предварительно покрывали матригелем (BD Biosciences, кат. № 356231, 10% матригель в PBS) в течение 30 минут при 37 ° C и промывали PBS. Клетки, обогащенные Dlk +, высевали в среду для разложения (DMEM / F-12, добавка lutaMAX ™ (ThermoFisher, каталожный № 31331028), 10% FB, 1 ITS-X (Gibco, Cat.№ 51500-056), 0,1 мкМ дексаметазона (Sigma-Aldrich, кат. № D1756-25MG), 10 мМ никотинамида (Sigma-Aldrich, кат. № N0636-100G), 10 нг / мл человеческого HGF (in- домашнее производство), 10 нг / мл EGF мыши (собственное производство). В 96-луночные планшеты клетки высевали при плотности 13 000 клеток / лунку, в 24-луночные планшеты — при плотности 60 000 клеток / лунку. Через 24 часа клетки покрывали средой для дифференцировки (MCDB131, без глутамина (Gibco, кат. № 10372019), 5% FBS, 2 мМ L-глутамина (ThermoFisher, кат. №M11-004), 1x ITS-X (Gibco, кат. № 51500-056), 0,1 мкМ дексаметазона (Sigma-Aldrich, кат. № D1756-25MG)), содержащий матригель до конечных 5%. Клетки культивировали в течение 5 дней при 37 ° C, 5% CO 2 с одной дополнительной заменой среды для дифференцировки. Dlk + клетки печени E14.5 содержали ~ 10% клеток, положительных по маркеру клеток желчных протоков Sox9, и использовались в экспериментах для оптимизации роста кист желчных протоков. Для других экспериментов использовали клетки Dlk + из печени E13.5, поскольку все клетки дали начало гепатоцитам с BC в вышеуказанных условиях культивирования.
Покадровая микроскопия живых клеток
Для видеомикроскопии живых клеток линии мышей LifeAct-EGFP (Riedl et al., 2010) и ROSAmT / mG (Muzumdar et al., 2007) были скрещены, и эмбрионы EGFP + были скрещены. собраны для выделения lk + клеток. Клетки lk + высевали (трансфицировали si NA) и отображали с 3-го дня культивирования на эпифлуоресцентном микроскопе Zeiss Axiovert 200 M с инкубатором (37 ° C, 5% CO 2 ) с использованием 20-кратного объектива (NA 0,5. ) с 10-минутными интервалами в течение примерно 52 часов.Для визуализации локализации EGFP-Rab35 клетки Dlk + выделяли из эмбрионов ROSAmT / mG и трансдуцировали рекомбинантным аденовирусом (AdenoEGFP-Rab35) на 2 день культивирования. Клетки были визуализированы на 3-й день с 5-минутными интервалами до 24 часов.
Иммунофлуоресцентное окрашивание и конфокальная визуализация
Культивируемые клетки фиксировали 3% PFA в течение 15 минут при комнатной температуре, промывали 3 раза PBS, пропитывали 0,1% Triton X-100 в PBS в течение 5 минут при RT и блокировали 0,5% FBS в PBS не менее 30 мин при комнатной температуре.Первичные антитела разводили в блокирующем растворе, крысиных моноклональных анти-CD13 (Novus, кат. № NB100-64843, 1: 500), кроличьих поликлональных анти-ZO-1 (Thermo Fisher Scientific, кат. № 40-2200, 1: 200), крысиный моноклональный анти-Цитокератин 19 (Sigma-Aldrich, кат. № MABT913, 1: 500) и козий поликлональный анти-альбумин (Novus, кат. № NB600-41532, 1: 200) и инкубировали. 1 час при комнатной температуре или в течение ночи при 4 ° C. Вторичные антитела (и / или красители фаллоидин-Alexa (Thermo Fisher Scientific, 1: 250) и DAPI (1 мг / мл, 1: 1000)) инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре.Для окрашивания кроличьими поликлональными антителами к Rab35 (Antibody Facility MPI-CBG Dresden, h36952, 1: 1000) клетки пермеабилизировали 0,05% сапонином и вместо этого блокировали 3% BSA в PBS. Наконец, клетки промывали PBS и отображали на лазерных сканирующих конфокальных микроскопах Olympus Fluoview 1000 (объективы 40x / 0,9 / воздух, 60x / 1,2 / вода), Zeiss LSM 700 (объективы 40x / 1,2 / вода, 20x / 0,8 / воздух).
Микроскопия локализации одиночных молекул
Эксперименты по микроскопии локализации одиночных молекул (SMLM) проводили на микроскопе Nikon Eclipse Ti, который подробно описан в другом месте (Franke et al., 2019). Перед сбором образцы облучали в режиме эпифлуоресцентного освещения, чтобы перевести излучатели, которые были не в фокусе в схеме освещения HILO для сбора данных, в темное состояние. Продолжительность сбора данных была установлена для захвата большинства излучателей, то есть визуализация была завершена, когда было обнаружено лишь очень небольшое количество активных излучателей. Когда впервые была достигнута критически низкая плотность пятен, использовалась схема сбора данных из 1 кадра с низким возбуждением (активацией) 405 нм, за которым следовали 5 последовательных кадров с возбуждением 641 нм.Типичная длина сбора данных составляла 60000-200000 кадров с временем интегрирования 20 мс и возбуждением 641 нм. Стеки необработанных изображений были проанализированы с помощью rapidSTORM 3.2 (Wolter et al., 2012). FWHM был установлен как параметр свободной подгонки, но в пределах 275–650 нм, что соответствует начальному диапазону примерно 1 мкм (Franke et al., 2016), радиус окна подгонки был установлен равным 1200 нм, порог интенсивности до 1000 фотонов, в то время как для всех остальных параметров подгонки были сохранены значения по умолчанию в quickSTORM 3.2.Коррекция линейного бокового смещения была применена путем пространственно-временного совмещения отдельных структур друг с другом. Этому способствовало цветовое кодирование временной координаты с помощью встроенного инструмента.
Просвечивающая электронная микроскопия
In vitro культуры гепатобластов, выращенные в 24-луночных планшетах, фиксировали добавлением теплого 2% -ного глутаральдегида в 200 мМ HEPES, pH 7,4 к культуральной среде в соотношении 1: 1 и инкубировали в течение 5 мин. при 37 ° С. Затем смесь фиксатора и среды заменяли добавлением свежего 1% глутарового альдегида в 200 мМ HEPES, pH 7.4, и образцы инкубируют при 37 ° C в течение еще 2 часов, затем при комнатной температуре в течение ночи. Для заливки смолы образцы пост-фиксировали 1% тетроксидом осмия и 1,5% феррицианидом калия в течение 1 часа на льду, затем контрастировали en-bloc 2% водным уранилацетатом в течение 2 часов при комнатной температуре, дегидратировали с помощью градуированной серии этанола: 70 -80-90-96%, каждый в течение 10 минут, и 4x 100%, каждый в течение 15 минут, постепенно пропитываются эпоксидной смолой LX-112 (Ladd Research Industries) и в конечном итоге полимеризуются при 60 ° C в течение 2 дней.Пластик пластины был отломан, чтобы высвободить смоляные диски с монослоем клеток с одной стороны. Диски разрезались на мелкие кусочки, которые были повторно установлены для продольной разрезки. Для сбора эмбриональной печени мыши беременную мышь умерщвляли и органы печени вырезали из эмбрионов и разрезали на несколько частей, которые фиксировали погружением 4% параформальдегидом в 200 мМ HEPES, pH 7,4, 1 мМ CaCl 2 в течение ночи. Перед заливкой смолы ткань печени разрезали на мелкие кусочки и дополнительно фиксировали 1% глутаровым альдегидом в 200 мМ HEPES, pH 7.4. Ткань обрабатывали, как описано выше, за исключением того, что для заливки использовали эпоновую смолу. Ткани были разрезаны случайным образом.
Последовательные 90-нм тонкие срезы были вырезаны с использованием ультрамикротома Leica Ultracut UCT и нанесены на покрытые формваром щелевые медные сетки. Срезы контрастировали 0,4% цитратом свинца в течение 1 мин и отображали в просвечивающем электронном микроскопе Tecnai T12 (ThermoFisher), работающем при 100 кВ и оборудованном аксиальной 2k CCD-камерой (TVIPS).
Z-стек изображений последовательных секций был выровнен с использованием плагина TrackEM2 на Фиджи (Cardona et al., 2012). Апикальную мембрану печени, просвет желчного канала и соединительный комплекс сегментировали на выровненных стопках изображений с помощью IMOD (Kremer et al., 1996) и Blender (Blender, 2010), чтобы реконструировать трехмерную модель.
Дизайн миРНК, синтез, трансфекция
Дизайн миРНК был выполнен с использованием собственного программного обеспечения, сначала путем тестирования всех доступных последовательностей на специфичность для мишени в транскриптоме мыши (RefSeq в Pubmed) с последующим удалением последовательностей со значительной комплементарностью к миРНК мыши, содержание GC ниже 25% и выше 75% и иммунно-чувствительные (такие как UGU, UGUGU и т. д.). Кроме того, последовательности были отфильтрованы с использованием правил Рейнольдса (Reynolds et al., 2004). Шесть миРНК с наивысшей оценкой функциональности были отобраны и синтезированы твердофазным фосфорамидитным методом, очищены с помощью IE-HPLC и проверены с помощью LC-MS (Farzan et al., 2017). Пиримидины в смысловой цепи и перед A в антисмысловой цепи (UA, CA динуклеотиды) были 2′-O-метилированы (показаны строчными буквами в последовательности), и обе цепи были 3′-модифицированы дитимидилатом фосфоротиоата (TsT) для усиления стабильность нуклеаз.Рабочие растворы получали разбавлением миРНК до 10 мкМ в 10 мМ Tris.HCl, pH 7,5. siRNA трансфицировали с использованием реагента для трансфекции Lipofectamine ™ RNAiMAX (Thermo Fisher cientific, Cat. No. 13778075) в соответствии с протоколом обратной трансфекции, предоставленным производителем. Конечная концентрация на лунку составляла 10 нМ si NA и 0,1 об.% Lipofectamine ™ NAiMAX.
Экстракция белка и вестерн-блоттинг
Культивируемые клетки лизировали в течение 20 мин в ледяном буфере для лизиса SDS (20 мМ трис-HCl, pH 7.5, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ EGTA, 1% SDS, 1% NP-40 (IGEPAL CA-630), недавно добавленный 1/1000 CLAAAP (химостатин, лейпептин, антипаин, апротинин, APMSF, пепстатин), 1/100 коктейль ингибиторов фосфатазы 2 и 3 (Sigma Aldrich). Для каждого условия пять лунок 96-луночного планшета объединяли вместе в 125 мкл буфера для лизиса SDS. Лизаты обрабатывали ультразвуком в течение 3 минут и центрифугировали при 13000 x g в течение 10 минут, 4 ° C. Концентрацию белка измеряли с помощью DC ™ Protein Assay (Bio-Rad, № по каталогу 500-0116).Образцы разделяли на 15% SDS-PAGE и переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Мембраны блокировали и инкубировали с первичными антителами кроличьего поликлонального анти-Rab35 (Antibody Facility MPI-CBG Dresden, F18256, 1: 1000) и мышиным моноклональным анти-γ-тубулином (Sigma-Aldrich, каталожный № T6557, 1: 2000). и вторичные HPR-конъюгированные антитела (1: 10000) в 5% сухом молоке, 10 мМ Tris-HCl pH 8,0, 200 мМ NaCl, 0,1% Tween20. Связанное антитело детектировали с помощью набора для определения вестерн-блоттинга CL ™ (GE Healthcare, Cat.№ RPN2209) на Hyperfilm ECL (Amersham GE Healthcare). Количественная оценка вестерн-блоттинга проводилась с помощью Image J (Miller, 2010), статистические данные рассчитывались, а графики строились в R (R Development Core Team, 2008).
Выделение РНК и RT-qPCR
Тотальную РНК выделяли с использованием RNeasy Mini Kit (Qiagen, кат. № 74104 50), включая стадию обработки ДНКазой I (Qiagen, кат. № 79254). Клетки лизировали RTL-буфером с добавлением DTT. кДНК синтезировали с использованием набора ProtoScript®II First Strand cDNA Synthesis Kit (NEB, Cat.No. E6560S) в соответствии с протоколом производителя с использованием Andom Primer Mi и стадией денатурации NA. КПЦР выполняли на Roche LightCycler® 96 в реакциях объемом 10 мкл с использованием FastStart Essential DNA Green Master (Roche, № по каталогу 06402712001). Ген домашнего хозяйства Rplp0 использовали в качестве эндогенного эталонного гена. Нормализованное значение относительной экспрессии генов и% нокдауна рассчитывали с использованием метода ΔΔCq (Haimes and Kelley, 2010), рассчитывали статистику и строили графики в R (R Development Core Team, 2008).
Массовое секвенирование РНК
Было проведено два независимых эксперимента. Для эксперимента А были собраны следующие четыре образца в 4 биологических повторностях: E14.5 Dlk + гепатобальсты, выделенные и немедленно обработанные для выделения РНК, in vitro, дифференцированных гепатоцитов из E14.5 Dlk + гепатобластов, дифференцированных в течение 4 дней в среде для дифференциации с 4% матригелем. выращенные на фибронектиновом покрытии зрелые гепатоциты, выделенные из взрослых мышей-самцов в соответствии с опубликованными протоколами (Klingmüller et al., 2006) и сразу же обработали для выделения РНК. Клеточная линия Chol / L выращивалась в виде монослоя или 3D-кисты в каплях 100% Matrigel до тех пор, пока поляризация не становилась видимой за счет правильной локализации апикальных и латеральных маркеров, а затем обрабатывалась для выделения РНК. Для эксперимента B образцы в 3 биологических повторах были собраны из in vitro, культивированных гепатобластов E13.5 Dlk +, трансфицированных siRNA, нацеленной на Rab35 (siRNA # 4), или контрольной люциферазы без нацеливания (siLuc) на 5 день культивирования. .Нокдаун мРНК Rab35 подтверждали с помощью RT-qPCR. Целостность РНК измеряли с помощью биоанализатора Agilent 2100. Предпочтительно использовали только образцы с числом целостности РНК (RIN)> 9,0. 1 мкг (эксперимент A) или 300 нг (эксперимент B) мРНК выделяли из общей РНК путем обогащения poly-dT с использованием модуля магнитной изоляции NEBNext Poly (A) мРНК в соответствии с инструкциями производителя. Окончательную элюцию проводили в 15 мкл 2 буфера для синтеза первой цепи c NA (NEBnext, NEB). После химической фрагментации путем инкубации в течение 15 минут при 94 ° C образец непосредственно подвергали рабочему процессу для подготовки библиотеки специфичных для цепей РНК-Seq (эксперимент A: N BNe t® Ultra ™ NA Library Prep Kit для Illumina®, эксперимент B: N BNe t® Ultra ™ II Directional RNA Library Prep Kit для Illumina®).Для лигирования использовались специальные адаптеры (Адаптер-Oligo 1: 5′-ACA CTC TTT CCC TAC ACG ACG CTC TTC CGA TCT-3 ‘, Адаптер-Oligo 2: 5’-P-GAT CGG AAG AGC ACA CGT CTG AAC TCC AGT САС-3 ‘). После лигирования адаптеры истощали очисткой гранул XP (Beckman Coulter), добавляя гранулы в соотношении 1: 1. Индексирование выполняли во время следующего обогащения ПЦР (15 циклов, 65 ° C) с использованием пользовательских праймеров для амплификации, несущих последовательность inde, обозначенную «NNNNNN». (Праймер 1: Oligo_Seq AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACT CTT TCC CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC T, праймер 2: GTG ACT GGA GTT CAG ACG TGT GCT CTT CCG ATC T, праймер 3: CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA NNNNNN GTG ACT GGA GTT.После еще двух очисток гранул XP (1: 1) библиотеки были количественно определены с использованием набора Qubit dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen). Для производства проточных ячеек Illumina образцы были эквимолярно объединены и распределены по всем дорожкам, используемым для секвенирования с однократным считыванием 75 п.н. на Illumina HiSeq 2500 (или Illumina NextSeq 500 для эксперимента B), что привело в среднем к 30 (или 33 для эксперимента B) секвенированным фрагментам. за образец.
Эксперименты по получению и спасению рекомбинантного аденовируса
Рекомбинантный аденовирус для экспрессии слитого с EGFP Rab35 (кДНК RAB35 человека, вариант транскрипта 1 (NM_006861.7)) был получен с использованием векторной системы AdEasy ™ (Qbiogen), разработанной (He et al., 1998). Линкер GGGGSGGGGS был введен между EGFP и RAB35. Фрагмент RAB35 с линкерным удлинением амплифицировали из плазмиды Addgene # 47424, подаренной Питером Макферсоном (Allaire et al., 2010), и субклонировали в вектор pEGFP-C3 (Clontech) с использованием сайтов рестрикции ScaI и BamHI. Фрагмент EGFP-линкер-RAB35 клонировали в вектор-переносчик pShutle-CMV (система векторов AdEasy, Qbiogen) с использованием сайтов рестрикции SalI и HindIII.Рекомбинантный вектор переноса линеаризовали с помощью PmeI и трансформировали в электрокомпетентный E . coli штамм BJ5183-AD-1 (Stratagene, кат. № 200157-11) для in vivo рекомбинации с вектором pAdEasy. Положительный клон амплифицировали в E.coli DH5α и линеаризовали с помощью PacI перед трансфекцией в упаковывающую клеточную линию QBI-293A (производное клеток Qbiogen HEK-293A). Вирус амплифицировали и очищали с помощью OptiPrep-gradient (раствор йодиксанола 60 мас. / Об.%, Axis Shield, Cat.No 1114542). Аналогичным образом получали контрольный вирус, содержащий только EGFP.
E13.5 Dlk + гепатобласты засевали и трансфицировали, как описано выше, с помощью миРНК Luc или миРНК Rab35 №4. 72 часа спустя клетки инфицировали рекомбинантным аденовирусом (EGFP или EGFP-Rab35) в разведении 1/1000 и 1/100 соответственно. Клетки культивировали еще 2 дня, фиксировали и окрашивали Phalloidin-Alexa 647 и DAPI. По полученным изображениям количественно оценивали «спасение» фенотипа просвета.
In utero siRNA-LNP инъекция
Для использования in vivo олигонуклеотиды siRNA были составлены в липидные наночастицы (LNP) с липидом C12-200, как описано ранее (Love et al., 2010). siRNA-LNPs были доставлены in utero в эмбриональную печень E13.5 через желточную вену, как описано в другом месте (Ahn et al., 2018). Мы оптимизировали концентрацию siRNA-LNP до 5 мг / кг массы тела и продолжительность лечения до 4 дней с использованием siRNA-LNP, нацеленных на мРНК GFP (Gilleron et al., 2013) в эмбрионах ROSAmG (полученных из скрещивания ROSA mG / mT x PGKCre (J) линий). Вес эмбрионов оценивался на основании опубликованных результатов (Kulandavelu et al., 2006). Вкратце, беременных мышей анестезировали в наркозном боксе изофлураном 5%, затем помещали на нагретый столик, прикрепленный к наркозной маске с потоком изофлурана в количестве 2-3%.Анальгезия обеспечивалась инъекцией 4 мг / кг метамизола непосредственно перед операцией и поддерживалась добавлением 1,33 мг / мл того же препарата в питьевую воду до умерщвления. Брюшко мышей брили, а затем стерилизовали этанолом; защищать глаза от высыхания увлажняющим кремом. Матку обнажили вертикальной лапаротомией. Затем эмбрионам вводили 5 мкл LNP в дозе 5 мг / кг. Успех инъекции оценивали по клиренсу крови из целевого сосуда. Эмбрионы одной и той же матери были случайным образом распределены как неинъектированные, инъецированные контрольной миРНК или инъецированные нацеливающей миРНК.Инъекции выполнялись вытянутыми иглами из стеклянных капилляров, помеченных вручную. После инъекций эмбрионы помещали обратно в брюшную полость и брюшную полость закрывали наложением швов. Затем эпидермис закрывали хирургическими зажимами. В конце операции мышей помещали рядом с нагревательной лампой и наблюдали до полного пробуждения. Печень собирали на E17.5.
Окрашивание ткани печени с оптическим просветом
Эмбриональную печень фиксировали погружением в PFA (4% PFA, 0.1% Tween20, PBS) в течение 2 часов при комнатной температуре и в течение ночи при 4 ° C. PFA нейтрализовали инкубацией в течение ночи в 50 мМ NH 4 Cl в PBS. Позднее печень хранили в PBS при 4 ° C до обработки. Печень помещали в 4% легкоплавкую агарозу в PBS и разрезали на срезы толщиной 100 мкм на вибратоме (Leica VT1200S). Для визуализации глубоких тканей срезы тканей были проницаемы с помощью 0,5% TtitonX100 в PBS в течение 1 часа при комнатной температуре. Первичные антитела крысиные моноклональные анти-CD13 (Novus, NB100-64843, 1: 500) и кроличьи моноклональные анти-Sox9 (Abcam, Cat.№ ab185966, 1: 500) разводили в буфере Tx (0,2% желатин, 300 мМ NaCl, 0,3% Triton X-100 в PBS) и инкубировали в течение 2 ночей при комнатной температуре. После отмывки 5 x 15 мин 0,3% TtitonX-100 в PBS срезы инкубировали со вторичными антителами осла против крысы 568 (BIOTIUM, каталожный № 20092, 1: 1000), ослиных антител против кролика 647 (Thermo Fisher Scientific , Кат. № A31573, 1: 1000) и DAPI (1 мг / мл, 1: 1000) и Phalloidin-Alexa488 (Thermo Fischer Scientific, Кат. № A12379, 1: 150) еще на 2 суток проживания.После отмывки 5 x 15 мин 0,3% TtitonX-100 в PBS и 3 x 1 мин с PBS, оптическое просветление началось с инкубации срезов в 25% фруктозе в течение 4 часов, продолжилось в 50% фруктозе в течение 4 часов, 75% фруктозы. в течение ночи, 100% фруктозы (100% мас. / об. фруктозы, 0,5% 1-тиоглицерина, 0,1 М фосфатный буфер, pH 7,5) в течение 6 часов и, наконец, в течение ночи в растворе SeeDB (Ke et al., 2013) (80,2% мас. / мас. фруктоза, 0,5% 1-тиоглицерин, 0,1 М фосфатный буфер). Образцы были смонтированы в SeeDB.
Количественная оценка и статистический анализ
Трехмерная реконструкция желчных канальцев
Оптически очищенные срезы печени размером 100 мкм получали с помощью вертикального многофотонного лазерного сканирующего микроскопа (Zeiss LSM 780 NLO), оборудованного детекторами на основе фосфида арсенида галлия (GaAsp).Срезы печени были визуализированы дважды с низким (объектив Zeiss 20x / 0,8) и высоким разрешением (объектив Zeiss 63x / 1,3, размер вокселя 0,3 мкм) соответственно. Были созданы обзоры с низким разрешением полных срезов печени, которые использовались для выбора областей, где были очевидны увеличенные апикальные мембраны. Выбранные области (~ 300 мкм x 300 мкм x 100 мкм; x, y, z) затем были получены с высоким разрешением. Изображения с высоким разрешением были обработаны и сегментированы желчные каналы на основе окрашивания CD13 с помощью программного обеспечения отслеживания движения, как описано (Morales-Navarrete et al., 2015; Моралес-Наваррете и др., 2016). Распределение локального радиуса просвета рассчитывалось исходя из максимального радиуса 10 мкм.
Для сегментации клеток выбранная область изображения (∼70 мкм x 70 мкм x 60 мкм; x, y, z) была удалена с помощью метода PURE-LET (Luisier et al., 2010), то есть через ‘ Плагин Pure enoise ‘в ImageJ с Cycle-spin = 10 и Multiframe = 11. Затем затенение и неравномерное освещение были исправлены с помощью алгоритма BaSiC (Peng et al., 2017) и плагинов Rolling Ball Background Subtraction на Фиджи соответственно.Предварительно обработанное изображение было импортировано в систему отслеживания движения, и апикальные мембраны были реконструированы, как описано выше. Клетки, окружающие апикальную трубку, были сегментированы с использованием подхода трехмерной активной сетки с окрашиванием фаллоидином в качестве маркера границы клеток, как описано в (Morales-Navarrete et al., 2015).
Количественная оценка радиуса просвета
Для количественной оценки эффекта подавления Rab35 и восстановления Rab35 на морфологию просвета in vitro для FIJI был написан специальный сценарий для сегментации просвета на микроскопических изображениях на основе сигнала актина (Phalloidin-Alexa 647) и извлечь статистику по региону.Для эксперимента по спасению маска сегментации была настроена таким образом, чтобы для анализа оставались только просветы с минимальным (70%) перекрытием с каналом GFP (экспрессируемый белок) (клетки, которые фактически экспрессируют белок). В скрипте была пауза для проверки сегментации и ручного исправления. Для количественного определения радиуса просвета мы использовали в качестве дескриптора «локальную толщину», которую можно вычислить с помощью плагина Fiji (https://imagej.net/Local_Thickness). Локальная толщина в любой внутренней точке объекта определяется как диаметр наибольшего круга, который содержит точку и полностью входит в объект.Для каждого просвета вычислялась гистограмма локальной толщины, а также средняя локальная толщина.
Затем была нормализована гистограмма локальной толщины каждого объекта. Чтобы учесть различный размер объектов, каждая нормализованная гистограмма была умножена на весовой коэффициент w i , который пропорционален предполагаемому объему объекта i. Не теряя общности, мы определили, где A i — количество пикселей, принадлежащих объекту.Затем гистограммы всех объектов на каждом изображении суммировались и нормализовались (т.е. чтобы исключить влияние различий в общем количестве апикальной мембраны между изображениями). Наконец, представлены усредненные гистограммы (сначала по разным изображениям, а затем между разными экспериментами N = 3). Планки погрешностей показывают стандартную ошибку среднего (SEM) на ячейку. Количественная оценка гистограммы была выполнена с использованием MATLAB R2020b.
Дифференциальный анализ экспрессии генов
Базовый контроль качества исходных данных секвенирования был выполнен с помощью FastQC v0.11.2 (Эндрюс, 2010). Считывания были сопоставлены с эталонной сборкой генома мыши GRCm38, а гены Ensembl release v92 (Zerbino et al., 2018) были количественно определены с использованием STAR v2.5.2b (Dobin et al., 2013). На основании уровня дублирования считывания, оцененного с помощью MarkDuplicates из инструментов Picard v2.10.2 (Broad Institute, 2018) и dupRadar v1.8.0 (Sayols et al., 2016), реплика 3 образца клеточной линии Chol / L (3D-кисты ) был идентифицирован как выброс и удален из набора данных «Эксперимент А.». Данные подсчета оставшихся образцов были отфильтрованы для генов с более чем 10 отсчетами в любом из образцов и служили входными данными для DESeq2 v1.22.2 (Love et al., 2014) для идентификации дифференциально экспрессируемых генов с использованием порога log2-кратного изменения, равного 1, и скорректированного порогового значения p-значения 0,01. Анализ дифференциальной экспрессии генов набора данных «Эксперимент B» был выполнен с использованием DESeq2 v1.18.1 с использованием порога изменения log2fold, равного 0,5. Мы скорректировали эффект партии из-за разных дней подготовки образцов. Тепловая карта и график вулкана были созданы с использованием пакетов R gplots (функция heatmap.2) и EnhancedVolcano соответственно.
Анализ обогащения набора генов (GSEA)
GSEA был проведен с использованием инструмента GSEAPreranked из программного обеспечения GSEA v4.1.0 (Mootha et al., 2003; Subramanian et al., 2005) с настройками по умолчанию. Для создания ранжированных списков генов для трех типов клеток применялся DESeq2 1.28.1 (Love et al., 2014). Списки генов были отфильтрованы для генов со значениями p <0,05, отсортированы в порядке убывания по их значениям log2FC и использованы в качестве входных данных для GSEA.
Дополнительное видео и таблицы
Видео Рисунок 1D: Образование BC in vitro
Покадровая микроскопия живых клеток, документирующая образование BC между двумя дифференцирующимися гепатобластами, экспрессирующими LifeAct-EGFP.Изображения получены с 10-минутными интервалами. Шкала шкалы: 10 мкм.
Видео Рисунок 2F: Анимация упрощенной модели BC с переборками
Упрощенная модель BC, основанная на трехмерной реконструкции на рисунке 2E с периодическими переборками мембранных соединений, содержащих плотные соединения (красные), образованные сверху или снизу вверх. дно просвета. Апикальная плазматическая мембрана просветообразующих клеток представлена зеленым и синим цветом.
Видео Фигура 4B ’: Кисты, образованные при подавлении Rab35 in vitro
Конфокальный z-стек показывает множественные цистоподобные структуры, образованные при подавлении Rab35 в дифференцирующихся гепатобластах in vitro .Клетки окрашивали на F-актин и ядра. Шкала шкалы: 30 мкм.
Видео Фигура 5A: Формирование сферического просвета при подавлении Rab35 in vitro
Покадровая микроскопия живых клеток, показывающая рост сферического просвета между двумя дифференцирующимися гепатобластами, экспрессирующими LifeAct-EGFP, при подавлении Rab35. Изображения получены с 10-минутными интервалами. Шкала шкалы: 10 мкм.
Видео Рисунок 5B: Формирование многоклеточной кисты in vitro при замалчивании Rab35
Покадровая микроскопия живых клеток, документирующая образование многоклеточной кисты при замалчивании Rab35 в дифференцирующихся гепатобластах, экспрессирующих LifeAct-EGFP.Изображения получены с 10-минутными интервалами. Шкала шкалы: 10 мкм.
Видео Рисунок 7CD: 3D-реконструкция просветной сети в печени, инъецированной LNP-siLuc или LNP-siRab35
Трехмерная реконструкция просвета, помеченного апикальным маркером CD13, в срезах ткани печени толщиной 100 мкм, инъецированных LNP-siLuc и LNP-siRab35. Сначала показано окрашивание CD13, затем трехмерная реконструкция на основе окрашивания. Вены показаны красным. Шкала шкалы: 30 мкм.
Видео Рисунок 7F: 3D-реконструкция канальца, сформированного в печени, инъецированной LNP-siRab35
Трехмерная реконструкция канальца, обнаруженного в печени, инъецированной LNP-siRab35.Сначала показано окрашивание CD13, затем восстановленный просвет зеленого цвета и, наконец, реконструированные клетки случайным цветом. Просвет окружен множеством клеток.
Доп. Видео S1: 3D-модель BC на основе данных ЭМ
Трехмерная реконструкция серийных срезов ЭМ на рис. 2B на основе визуализации апикальных плазматических мембран и плотных контактов. Апикальная плазматическая мембрана клеток, образующих просвет, выделена зеленым и синим цветом, плотные контакты выделены красным.
Видео Рисунок S1A: Формирование множественных просветов BC одним дифференцирующимся гепатобластом
Покадровая микроскопия живых клеток, документирующая образование нескольких просветов BC одним дифференцирующимся гепатобластом, экспрессирующим LifeAct-EGFP.Изображения получены с 10-минутными интервалами. Шкала шкалы: 10 мкм.
Видео Рисунок S1B: Ветвление и слияние просвета BC
Покадровая микроскопия ветвления и слияния просветов BC живых клеток, образованных дифференцирующимися гепатобластами, экспрессирующими LifeAct-EGFP. Изображения получены с 10-минутными интервалами. Шкала шкалы: 10 мкм.
Видео Рисунок S1C: Восстановление канальцевого просвета BC
Покадровая микроскопия живых клеток, документирующая изменение сферического просвета канальцевого просвета в дифференцирующихся гепатобластах, экспрессирующих LifeAct-EGFP.Изображения получены с 10-минутными интервалами. Шкала шкалы: 10 мкм.
Таблица S1 (относится к рисункам 4 и S4): гены, включенные в сфокусированный экран siRNA
Таблица S2 (раздел, посвященный методам): последовательности siRNA, используемые в исследовании
Таблица Excel
Благодарности
Мы благодарны Арно Эшарду за обсуждения и обмен реактивами. Мы благодарим докторов наук. Meritxell Huch, Elisabeth Knust, Kai Simons, Ivan Baines и Janelle Lauer за стимулирующие обсуждения и критическое прочтение рукописи.Мы благодарим Сандру Сегелец за то, что она поделилась своим опытом в области производства рекомбинантных аденовирусов и визуализации живых клеток, и Александру Калайдзиду за визуализацию. Мы благодарим Центр генома DRESDEN за услуги по массовому секвенированию РНК и за поддержку Light Microscopy Facility, основного объекта технологической платформы CMCB в Техническом университете Дрездена. Мы хотели бы поблагодарить следующие службы и объекты Института молекулярной клеточной биологии и генетики им. Макса Планка за их поддержку: центр по разработке антител, биомедицинские услуги, центр электронной микроскопии, центр световой микроскопии, центр экспрессии, очистки и характеристики белков (PEPC), и Научно-вычислительный центр, в частности, Лена Херсеманн и Норин Уокер.
Это исследование было выполнено при финансовой поддержке Федерального министерства исследований и образования Германии (BMBF) (LiSyM, номер гранта 031L0038), Европейского исследовательского совета (ERC) (номер гранта 695646), Deutsche Forschungsgemeinschaft (F, Немецкий исследовательский фонд) в рамках Стратегия совершенства Германии — EXC-2068– 3961– Кластер передового опыта в области физики жизни Университета Дрездена и Общества Макса Планка (MPG).