admin 5. Праймеры — «затравка» для репликации. Это короткий фрагмент, состоящий из рибонуклеотидтрифосфатов (2
Основные этапы репликации.
1.Инициация репликации.
Происходит
под влиянием внешних стимулов (факторов
роста). Белки соединяются с рецепторами
на плазматической мембране и вызывают
репликацию в синтетическую фазу
клеточного
цикла. Смысл инициации заключается в
присоединении в точку репликации DNA—A,
стимулирующего
расхождение двойной спирали. В этом
принимает участие и ХЕЛИКАЗА. Действуют
ферменты (ТОПОИЗОМЕРАЗЫ), вызывающие
раскручивание сверх спирали. SSB-белки
препятствуют соединению дочерних цепей.
Образуется РЕПЛИКАТИВНАЯ ВИЛКА.
Образование дочерних нитей.
Этому
предшествует образование ПРАИМЕРОВ с
помощью фермента ПРАЙМАЗЫ. Действует
ДНК-ПОЛИМЕРАЗА и образуется дочерняя
нить ДНК. Этот процесс происходит в
соответствии с принципом комплиментарности,
и синтез идёт от 5′ к 3′ концу синтезируемой
нити.
На
одной из материнских нитей будет
строиться непрерывная цепь,
а на противоположной нити — цепь из
коротких фрагментов (фрагментов ОКАЗАКИ)
Удаление ПРАИМЕРОВ с помощью ЭКЗОНУКЛЕАЗЫ.
Соединение коротких фрагментов с
помощью ДНК-ЛИГАЗЫ.
Дочерние
нити КОМПЛИМЕНТАРНЫ материнским.
Дочерние молекулы ДНК являются копией
материнской
ДНК. Значение
репликации: воспроизведение генотипа
в поколениях.
2. Репарация днк.
ДНК
человека содержит примерно 3 млрд.
НУКЛЕОТИДОВ. Если появится одна ошибка
на 1млн.
НУКЛЕОТИДОВ, то в целом в молекуле ДНК
будет 3000 ошибок за один процесс репликации.
Ошибки в репликации могут привести к
летальному исходу. В
организме существует система, исправляющая
ошибки — система репарации ДНК. Она
состоит
из трёх ферментов:
— ЭНДОНУКЛЕАЗА,
— ЭКЗОНУКЛЕАЗА,
— ДНК-ПОЛИМЕРАЗА РЕПАРИРУЮЩАЯ.
—
ЭНДОНУКЛЕАЗА вызывает разрыв фосфодиэфирных
связей повреждённого НУКЛЕОТИДА с
соседним,
с той или с другой стороны.
В результате
образуется два конца. В действие вступает
ЭКЗОНУКЛЕАЗА,
отщепляющая НУКЛЕОТИДЫ с образующихся
концов ДНК в обе стороны. В
результате действия этих ферментов на
одной нити ДНК возникает дефект. В работу
вступает
ДНК-ПОЛИМЕРАЗА РЕПАРИРУЮЩАЯ. Она
достраивает повреждённую цепь в
соответствии с принципом комплиментарности.
Т.о. повреждённый НУКЛЕОТИД удаляется.
3. Транскрипция гена.
Транскрипция
— передача информации с ДНК на РНК
(биосинтез РНК). Транскрипции,
в отличие от репарации, подвергаются
только определённые части молекулы
ДНК. Эта часть
называется ТРАНСКРИПТОНОМ — фрагмент
ДНК, транскрибируемый в РНК. ДНК
эукариот прерывистая: участки, несущие
информацию (ЭКЗОНЫ), чередуются с
участками, не
несущими информацию (ИНТРОНЫ). В
ДНК с 5′-конца выделяют ПРОМОТОРНУЮ
область — место присоединения
РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ.
С 3′-конца — ТЕРМИНАТОРНАЯ зона. Эти
области не транскрибируются.
УСЛОВИЯ ТРАНСКРИПЦИИ.
1. Матрица — 1 нить ДНК. Образуется
транскрипционный глазок.
2. Структурные компоненты —
РИБОНУКЛЕОЗИД-3-ФОСФАТЫ (АТФ, ГТФ, ЦТФ,
УТФ). Они будут распадаться до МОНОФОСФАТОВ
с выделением энергии.
3. ДНК-зависимая РНК-ПОЛИМЕРАЗА.
ОСНОВНЫЕ ЭТАПЫ ТРАНСКРИПЦИИ.
1.
ИНИЦИАЦИЯ.
Заключается
в присоединении РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ к
ПРОМОТОРУ, что приводит к расхождению
нитей ДНК. Импульсом к присоединению
РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ является присоединение
ТВР-белка к TATA-САЙТУ.
2.
ЭЛОНГАЦИЯ (удлинение).
Соединение
РИБОНУКЛЕОЗИДМОНОНУКЛЕОТИДОВ и
образование фосфодиэфирных
связей
между НУКЛЕОТИДАМИ с помощью РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ,
которая передвигается
вдоль нити ДНК.
Присоединение НУКЛЕТИДОВ идет в
соответствии с принципом
комплиментарности,
только вместо
ДЕЗОКСИНУКЛЕОТИДОВ
будут РИБОНУКЛЕОТИДЫ,
и вместо ТМФ — УМФ.синтез
идёт со скоростью 30 — 50 НУКЛЕОТИДОВ в
секунду, пока не дойдёт до Т-зоны.
3.
ТЕРМИНАЦИЯ (окончание).Заключается в
том, что со стороны 3′-конца образованной
РНК присоединяется множество (до 200
— 300) АДЕНИЛОВЫХ НУКЛЕОТИДОВ — поли А.
Образуется
точная копия гена. АДЕНИЛОВЫЕ НУКЛЕОТИДЫ
защищают 3′-конец от действия ЭКЗОНУКЛЕАЗ.
С 5′-конца образуется защита, так называемый
«САР» (чаще всего УДФ). Эта
образовавшаяся копия гена называется
ТРАНСКРИПТ.
4.
ПРОЦЕССИНГ (созревание).
Заключается
в СПЛАЙСИНГЕ удаление неинформативных
участков, и соединение ЭКЗОНОВ
между собой. Играет важную роль в эволюции
организмов, т.к. возможен альтернативный
СПЛАЙСИНГ. Это свидетельствует о том,
что из одной пре-ИРНК образуется несколько
ИРНК и соответственно несколько белков,
что проявляется в разнообразии признаков
у
организмов.
Лекция
№ 20. Биосинтез
белка.
1.БЕЛОКСИНТЕЗИРУЮЩИЙ АППАРАТ.
2.ТРАНСЛЯЦИЯ.
3.РЕГУЛЯЦИЯ
БИОСИНТЕЗА БЕЛКА.
БИОСИНТЕЗ
БЕЛКА.
Трансляция
или собственно биосинтез белка — это
перевод генетического текста М-РНК в
последовательность
аминокислот в белке. Характеристика
белоксинтезирующего аппарата клетки.
1.
МРНК — источник информации.
У
эукариот имеется особенность — САР
(шапка, кепка), представленная МЕТИЛ-ГТФ.
САР защищает МРНК от гидролиза и
способствует её соединению с РИБОСОМАМИ.
С САР связываются
САР-связывающие белки. На МРНК находится
стартовый кодон, представленный
триплетом АУГ, представленный аминокислотой
— МЕТ.
РИБОСОМЫ
— комплексы РРНК с порядка 80 белками,
включая ферменты.
РИБОСОМА состоит
из двух единиц- большой и малой. Она у
ЭУКАРИОТ более крупная,
её формула
80S (40S
и 60S). У ПРОКАРИОТ она имеет формулу 70S
(30S
и 50S)
Аминокислоты (20 видов).
ТРНК(31 вид).
Несоответствие
числа транспортных РНК и числа кодонов
(61) снимается за счёт возможности
узнавания одной транспортной РНК
нескольких кодонов данной аминокислоты
(ГЛИЦИН
имеет три варианта ДНК-кода — ГГУ, ГГЦ,
ГГА).
Все эти 3 варианта узнаются одним
видом Т-РНК — ЦЦН. В состав транспортной
РНК входят минорные азотистые основания,
способные узнавать вариабельный участок
разных кодонов одной и той же аминокислоты.
Транспортная РНК выполняет функцию
АДАПТОРА между МРНК
и белком.
Фермент
синтеза комплекса транспортной РНК с
аминокислотой — АМИНОАЦИЛ-ТРНК-СИНТЕТАЗА
(требует энергии АТФ).
Белковые факторы:
факторы
ИНИЦИАЦИИ (ФИ) начала трансляции, факторы
ЭЛОНГАЦИИ (ФЭ) — продолжатели, факторы
ВЫСВОБОЖДЕНИЯ (R-факторы).
Ионы магния, как КОФАКТОРЫ.
АТФ, ГТФ — поддержка энергией.
Этапы трансляции:
Термоциклеры для амплификации образцов ДНК и РНК с помощью ПЦР
Главная→
Информация для покупателей→
Информация о товарах→
Термоциклеры для амплификации образцов ДНК и РНК с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР)
01 марта 2021
Амплификаторы (ДНК-циклеры, термоциклеры, ПЦР-машины) являются приборами, обеспечивающими сверхточный (не менее 0,1 °C) переход от периодов охлаждения до периодов нагрева пробирок и используемыми в молекулярно-биологическом исследовании для амплификации ДНК посредством ПЦР.
Термоциклеры способны задать необходимое число циклов, выбрать максимально подходящие временные и температурные интервалы любой из процедур цикла. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) является основным методом получения генов, который базируется на способности ДНК-полимеразы образовывать вторую цепочку ДНК, используя для этого комплементарную цепочку, повторяя процесс репликации ДНК, происходящий в живой клетке. Начало репликации в ПЦР задают два небольших фрагментов ДНК (затравки, или праймеры), комплементарные концам реплицируемого гена на обоих нитях ДНК. В начале ДНК хромосомы с интересующим геном нужно смешать с праймерами и нагреть до 94–99 °С с целью достижения разрыва связей водорода и расхождения ДНК-цепей. Это этап называется денатурацией.
Затем начинается этап присоединения, или отжига праймеров, он проходит при температуре от 40 до 75 °С. Праймер, или затравка — это прицельно выбранный ограниченный фрагмент ДНК, комплементарно соответствующий изучаемому отрезку ДНК-матрицы.
Итак, температура понижается до 40–75 °С (на уровень выставляемой температуры влияет длина и последовательность праймеров). Такие условия обеспечивают соединение затравок с комплементарными участками хромосомной ДНК, и образуется правильная двойная спираль.
Потом начинается следующий этап, этап элонгации ДНК, или синтеза новой цепочки ДНК, он проходит при температуре 60–75 °С. Для его осуществления добавляются четыре необходимых для синтеза нити ДНК нуклеотида и ДНК-полимераза. Благодаря последней праймеры удлиняются, строится двуспиральная ДНК от локуса крепления праймеров (концы гена) до окончания цепи хромосомной ДНК. При повторном нагревании в этой смеси будет снова наблюдаться расхождение цепей, тех, что были синтезированы, а при повторном охлаждении и добавлении праймеров вновь начнется синтез, но на этот раз с противоположной стороны, т.е. будет построена первоначальная последовательность, как в гене. Повторяя вновь и вновь нагрев и охлаждение в том же духе, можно удвоить количество нужных последовательностей (они ограничены с обоих концов введенными праймерами) в каждом из циклов.
25 подобных циклов увеличивает количество копий гена примерно в миллион раз. И этого объема хромосомной ДНК вполне достаточно для исследования. Обычно в исследованиях используют от 20 до 40 циклических процессов. Посредством ПЦР, при использовании исходного образца в качестве матрицы, можно получить большое количество копий гена in vitro, повысив в пробе содержание нужной последовательности более чем стократно.
ДНК-амплификаторы или термоциклеры представляют собой программируемые термостатирующие устройства, способные циклически повторять свою программу работы. Самыми важными функциональными показателями приборов, которые напрямую изменяют скорость полимеразной цепной реакции и ее качество, стали скорость линейного изменения и уровень точности выставленных температур. Основу конструкции любого циклера составляют термоблок и термостатирующая и управляющая системы. Первый закрепляет в неподвижном состоянии набор используемых реакционных сосудов (обычно это пробирки из медицинского пластика объемом 0,2 миллилитра) и обеспечивает теплопередачу.
Кроме отдельно стоящих пробирок, могут использоваться стрипы по 8 шт. и 96-луночные планшеты.
Термоблоки бывают твердотельными или роторными. Первые используются чаще, они выполнены из сплава с высоким уровнем теплопроводности и имеют специальные углубления для реакционной посуды, роторные же просто закрепляют пробирки неподвижно и термостатирование осуществляют исключительно воздушное. Для оценки работы термоблоков используют такие параметры, как уровень теплопроводности (он должен быть высоким) и степень однородности температур (в современных приборах этот показатель достигает 0,1 °C). Важным критерием оценки качества термоблока является наличие нагреваемой крышки (оснащение крышки нагревательным элементом). «Горячая крышка» предотвращает выпаривание рабочей жидкости. Крышка может быть откидной, либо внутренней, когда термоблок выдвигается наподобие DVD-привода. В устройствах, где «горячая крышка» отсутствует (они устарели) для этих целей на реакционную смесь наносится один из видов минерального масла.
Термостатирующая система в термоциклерах последних генераций — это элементы Пельтье, радиатор и вентилирующее устройство. Такое строение гарантирует быстроту изменения температур, максимальную независимость от микроклимата окружающей среды. Кроме того, такие системы надежны и компактны благодаря простоте своей конструкции.
Ранее использовавшиеся как термостатирующие системы наборы из водяных бань или твердотельных термоблоков, где каждый температурный «уровень» имел фиксированную температуру, а реакционная посуда переносилась механически, резистивный нагрев и охлаждение воздушными потоками проводилось при этом либо принудительно, либо пассивно.
Система управления современных моделей — это встроенный микрокомпьютер, контролирующий четкую и быструю сменяемость температурных уровней для каждого из этапов амплификации. Пользователи могут осуществлять ввод информации с клавиатуры или с алфавитно-цифрового или графического дисплея. Современные модели премиум уровня оснащены цветными сенсорными экранами с повышенным уровнем разрешения с интерфейсом, подобным интерфейсу мобильных дивайсов, а также расширенным сервисным функционалом.
Их можно подключать к ПК, в них предусмотрена возможность ведения журнала работы, а также распечатки данных и т.д.
Современные модели имеют и ряд других полезных функций. Например, Real-Time PCR — с помощью этой функции можно проводить ПЦР в реальном времени, такие приборы оснащены детектирующими флуоресценцию устройствами, реагирующими на флуоресцентный сигнал рабочего раствора. В моделях с твердотельными термоблоками детекция происходит сквозь крышки пробирок, что сможет снижать качество, а в моделях с роторными термоблоками — сквозь дно пробирок, что предпочтительнее.
К другим усовершенствованиям современных амплификаторов относятся оснащение их сменными термоблоками, возможность задания необходимого температурного градиента, оснащение калькулятором температурных режимов (на базе нуклеотидной последовательности праймеров), электрифицированное открывание крышки термоблока, голосовое управление и др.
Наша компания предлагает самое надежное и самое современное оборудование для ПЦР.
У нас вы найдете лучшие приборы, лучшие цены на них и лучший сервис. Наши консультанты всегда помогут вам с выбором наиболее подходящего амплификатора.
Бренды по теме
НПО ДНК-Технология
Артикул по умолчанию.PRICE2}}
{{{ defaultSku.formattedPrice }}}
{{/defaultSku.PRICE2}}
{{/globals.variables.show_untaxed_price}}
{{#globals.variables.show_untaxed_price}}
{{{ globals.t.product.price_without_tax }}} {{{ defaultSku.formattedPrice }}}
{{{ globals.t.product.price_with_tax }}} {{{ defaultSku.formattedTaxedPrice }}}
{{/globals.variables.show_untaxed_price}}
{{# заштриховано}}
{{{ defaultSku.SHADENAME }}}
9Артикул по умолчанию.PRICE2}}
{{{ formattedPriceRange }}}
{{/defaultSku.PRICE2}}
{{/globals.
variables.show_untaxed_price}}
{{#globals.variables.show_untaxed_price}}
{{{ globals.t.product.price_without_tax }}} {{{ formattedPriceRange }}}
{{{ globals.t.product.price_with_tax }}} {{{ taxPriceRange }}}
{{/globals.variables.show_untaxed_price}}
{{/ sku_as_product }}
Масляные, акриловые и латексные грунтовки Ace Hardware
Выберите 2 или более продуктов для параллельного сравнения характеристик. Сравните
Выберите 2 или более продуктов для параллельного сравнения характеристик. Сравните
Выберите 2 или более продуктов для параллельного сравнения функций. Сравните
Выберите 2 или более продуктов для параллельного сравнения -боковое сравнение функций.
СравнитьВыбрать 2 или более продуктов для бок о бок по сравнению с функциями comparrishson.compare
Выбрать 2 или более продуктов для боковых функций сравнение. Выберите 2 или более продуктов для параллельного сравнения характеристик. Сравните
Выберите 2 или более продуктов для параллельного сравнения характеристик. Сравните
Выберите 2 или более продуктов для параллельного сравнения характеристик. Сравните
Выберите 2 или более продуктов для параллельного сравнения характеристик. Сравните
Выберите 2 или более продуктов для параллельное сравнение функций.
СравнитеВыберите 2 или более продуктов для параллельного сравнения функций. сравнение.Сравнить
Выбрать 2 или более продуктов для бок о бок по сравнению с функциями сравнения.
Выберите 2 или более продуктов для параллельного сравнения функций. Сравните
Выберите 2 или более продуктов для параллельного сравнения функций. Сравните
Выберите 2 или более продуктов для параллельного сравнения характеристик. Сравните
Выберите 2 или более продуктов для параллельного сравнения характеристик. Сравните
Выберите продукты или более для параллельного сравнения функций.
СравнитеВыберите 2 или более продуктов для параллельного сравнения функций. Сравните
Выберите 2 или более продуктов для параллельного сравнения сравнение функций.Сравнить
Выбрать 2 или более продуктов для бок о бок по сравнению с функциями comparrishson.compare
Выбрать 2 или более продуктов для боковых функций Comparrison.compare
. Выберите 2 или более продуктов для параллельного сравнения характеристик. Сравните
Выберите 2 или более продуктов для параллельного сравнения характеристик.
90253
4 больше продуктов для параллельного сравнения функций. Сравните
Сравнить
Сравните
Сравните